本发明专利技术公开了一种抗CD20单链抗体的植物种子表达系统，它是按VL-VH-Linker-hIgG1Fc顺序，在基因的5’端有编码大麦α-Amylase信号肽序列的核苷酸序列，设计并人工合成了抗CD20单链抗体基因，将基因插入植物种子特异表达载体p1301b中，通过农杆菌介导法转化植株；将带有种子特异性启动子，抗CD20单链抗体基因和终止子的表达框整合进植物基因组中；筛选和培养出了带有上述基因的植株，进一步通过筛选和扩繁得到了纯合植株，该纯合植株所产生的种子中含有所述的抗CD20单链抗体；重组蛋白定向表达在液泡内；表达的抗CD20单链抗体具有生物学活性，对Daudi细胞的ADCC杀伤能力与Rituxan无显著差异。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属基因工程
，具体涉及抗CD20单链抗体基因及利用植物种子特异性表达启动子在植物种子中高效表达抗CD20单链抗体的方法。
技术介绍
根据《2012中国肿瘤登记年报》显示，目前我国每年新发癌症病例约312万，因癌症死亡超过200万。恶性肿瘤已经成为我们城乡居民的第一位死亡原因。非霍奇金氏淋巴瘤（Non Hodgkin’s lymphoma, NHL）是最常见的淋巴系统恶性肿瘤，其中绝大多数为B细胞淋巴瘤。CD20抗原是一种B细胞分化抗原，位于B细胞的表面，仅存在于成熟B细胞和B细胞前体中，在正常组织中不表达，而在95%以上的B细胞淋巴瘤中均有过量表达。这也使CD20成为了治疗B细胞淋巴瘤的一个理想靶点。Rituxan（Rituximab，美罗华）为美国罗氏公司产品，是一种人鼠嵌合抗体。Rituxan于1997年获得FDA批准上市，是第一个被批准用于治疗恶性肿瘤的单克隆抗体。目前用于治疗低恶度、滤泡型B细胞淋巴瘤。 随着对Rituxan治疗其他一些自身免疫性疾病研究的深入，Rituxan在临床疾病治疗方面的潜在价值将会被进一步开发，社会对其的需求也越来越大。但是由哺乳动物细胞（CHO）生产的Rituxan需要昂贵的设备和培养基，从而增加了其生产成本，导致其价格高昂（一疗程的费用约20万元人民币左右）。 利用植物反应器已经成功的表达了多种具有生物活性和功能的药用蛋白，其中包括单克隆抗体、疫苗抗原、治疗用酶、血液蛋白、细胞因子、生长因子和生长激素等。而以植物作为生物反应器则具有诸多的特点和优点：（1）可根据重组蛋白的需求来选择不同形式的表达体系，可分为整株表达和组织特异性表达，如种子、须根，以及悬浮细胞等；（2）大规模生产时具有较低的生产成本和灵活性；（3）植物具有与哺乳动物细胞相似的蛋白翻译后修饰途径，从而获得有功能的活性蛋白；（4）较高的安全性，不携带动物病原体；（5）便于储藏和运输。 尽管豆类和谷类等种子植物相对于叶类作物产生较少的生物量，但却为储存提供了极佳的条件。叶类作物在采样后，叶片需要冰冻或干燥以备运输，或立即进行处理；而成熟的种子却可以在室温下长时间存储。在长期的进化过程中，种子作为植物的贮藏器官，可以在很小的空间内积累大量的蛋白质，且种子中含有丰富的分子伴侣、适宜蛋白质折叠的环境以及较少的蛋白激酶。此外，大多数的种子体积较小，这样可以使表达的重组蛋白高度集中，虽然总生物产量并没有叶片植物高，但却有利于蛋白质的下游提取和纯化；而且植物种子表达重组蛋白，不会影响植物的生长。而通过将重组蛋白定向表达至液泡中存储，不仅可以获得完整的翻译后修饰，还可以提高重组蛋白的表达量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种融合基因，抗CD20单链抗体基因，以及利用植物种子表达系统表达抗CD20单链抗体基因，生产抗CD20单链抗体。 抗CD20单链抗体基因，它包括：轻链可变区-重链可变区-连接肽-人免疫球蛋白G的Fc片段并且在其5’端加入了编码大麦α-Amylase的信号肽序列； 所述的抗CD20单链抗体基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示； 一种植物表达载体质粒，它是在植物表达载体中插入了上述的抗CD20单链抗体基因； 所述的植物表达载体为植物种子特异表达载体p1301b； 所述的植物种子特异表达载体p1301b，是由下述方法构建的：人工合成了β-phaseolin的启动子和终止子序列，并在启动子两端分别添加Xho I和Nco I酶切位点，在终止子两端分别添加Hind III和Kpn I酶切位点；并通过KpnI和Bst EII双酶切的方法从pBASTA质粒上获得35S+Bar基因；同时利用Kpn I和Bst EII双酶切pCambia1301，连入35S+Bar原件，构建中间载体p1301Bas。再通过酶切，连接反应将β-phaseolin的启动子和终止子原件连接至p1301Bas中； 抗CD20单链抗体，它是由下述方法生产的： 1、将上述的一种植物表达载体质粒，转化至根瘤农杆菌EHA105中； 2、再将根瘤农杆菌转染至植物中； 3、培育所述的植物，采集种子；提取抗CD20单链抗体蛋白； 所述的植物为拟南芥、红花、玉米或亚麻芥。 上述的抗CD20单链抗体在制备治疗非霍奇金氏淋巴瘤及自身免疫性疾病药物中的应用。 本专利技术提供了一种抗CD20单链抗体的植物种子表达系统，它是按VL-VH-Linker-hIgG1Fc顺序，在基因的5’端有编码大麦α-Amylase信号肽序列的核苷酸序列，设计并人工合成了抗CD20单链抗体基因，将基因插入植物种子特异表达载体p1301b中，通过农杆菌介导法转化植株；将带有种子特异性启动子，抗CD20单链抗体基因和终止子的表达框整合进植物基因组中；筛选和培养出了带有上述基因的植株，进一步通过筛选和扩繁得到了纯合植株，该纯合植株所产生的种子中含有所述的抗CD20单链抗体；重组蛋白定向表达在液泡内；且表达的抗CD20单链抗体具有生物学活性，对Daudi细胞的ADCC杀伤能力与Rituxan无显著差异。 采用本专利技术的方法生产抗CD20单链抗体具有如下优点： 1、通过采用分泌型表达，重组蛋白可以获得正确的折叠，组装和修饰，并且定向储藏在液泡内，确保了重组药用蛋白的生物学活性的获得； 2、利用植物表达外源蛋白可以避免大肠杆菌内毒素和动物病原体的污染； 3、通过利用种子特异性强启动子，可有效提高重组蛋白的表达量； 4、利用植物种子表达系统生产抗CD20单链抗体，可以有效降低生产成本，同时有利于抗CD20单链抗体的产业化。 附图说明 图1是人工合成的植物密码子偏好性的抗人CD20单链抗体基因的酶切鉴定图；其中：1、DL2000， 2--4、质粒，5、对照质粒，6、DL15000； 图2是植物种子表达载体p1301-Ri的构建过程示意图； 图3是表达载体p1301-Ri的双酶切鉴定图；其中：1、DL2000， 2、质粒； 图4是表达载体p1301-Ri的结构详细示意图； 图5是转基因拟南芥种子的SDS-PAGE电泳图；其中：1、非转基因拟南芥，2--4、转基因拟南芥； 图6是抗人CD20单链抗体在拟南芥种子中表达的Western Blot检测图；其中：1--6、转基因拟南芥，7、非转基因拟南芥； 图7是抗人CD20单链抗体的生物学活性检测图。 具体实施方式 实施例1中间载体p1301b的获得 根据TC.本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗CD20单链抗体基因，它包括：轻链可变区‑重链可变区‑连接肽‑人免疫球蛋白G的Fc片段，并且在其5’端加入了编码大麦α‑Amylase的信号肽序列。
【技术特征摘要】
1.抗CD20单链抗体基因，它包括：轻链可变区-重链可变区-连接肽-人免疫球蛋白G的Fc片段，并且在其5’端加入了编码大麦α-Amylase的信号肽序列。
2.根据权利要求1所述的抗CD20单链抗体基因，其特征在于：它的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种植物表达载体质粒，它是在植物表达载体中插入了权利要求1所述的抗CD20单链抗体基因。
4.根据权利要求3所述的一种植物表达载体质粒，其特征在于：所述的植物表达载体为植物种子特异表达载体p1301b。
5.根据权利要求4所述的一种植物表达载体质粒，其特征在于：所述的植物种子特异表达载体p1301b，是由下述方法构建的：人工合成了β-phaseolin的启动子和终止子序列，并在启动子两端分别添加Xho I和Nco I酶切位点，在终止子两端分别添加Hind III和Kpn I...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜潮，李校堃，王德仲，李海燕，刘秀明，姚娜，金立波，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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