本发明专利技术公开了广谱结合流感病毒A的重组抗体及其制备方法与应用。其中一种为单链抗体（scFv形式），其可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。另一种为单域重链（VH形式）不含轻链,其可变区具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列及SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。公开了编码单域抗体VH三聚物（VH‑trimer）抗体的氨基酸序列SEQ ID NO:5及其核苷酸序列SEQ ID NO:6。本发明专利技术所述抗体片段能够与流感病毒A（Influenza A Virus）蛋白保守区特异性地结合，其亲和力不低于10‑7M。本发明专利技术涉及的抗体片段在治疗流感病毒A引起的人流行感染疾病中具有潜在应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗体应用
涉及广谱流感病毒A人源重组抗体 设计及制备的潜在用途。具体地说是广谱结合流感病毒A的重组抗体片段及其制备方法与应用。
技术介绍
流行性感冒病毒（influenza virus）分为甲(A)、乙(B)、丙(C )3个型，其中甲型流感病毒不仅可以感染人，还可以感染与人类生活密切相关的马、猪等哺乳动物、鸟类和家禽类，因此甲型流感病毒可引起跨种间、爆发式的大范围流行感冒，严重威胁人类生命健康。流感病毒的外膜上有两种蛋白，一种为血凝素（hemagglutinin，HA），一种为神经氨酸酶（neuraminidase，NA），两者均易发生变异，导致流感病毒血清型众多，变异速度较快，成为流感预防和治疗的困惑。因此，开发广谱抗流感抗体具有重要的临床需求。HA为一种糖蛋白，在病毒侵染细胞时发挥重要作用。HA蛋白的头部与细胞面膜的唾液酸结合，病毒被细胞内吞进入细胞内，随后HA的发生构象改变，使病毒囊膜与细胞膜融合，病毒基因就释放在细胞内。目前临床应用中的抗流感病毒HA抗体主要针对HA的头部结合，由于HA头部是高度可变区。因此，很多抗体不具有广谱抗流感的作用。CR6261是近年来通过噬菌体展示技术筛选获得的中和抗体，能够抵御多种亚型的流感病毒，包括中和H1、H2、H5、H6、H8和H9亚型病毒[1]。已有报道证实CR6261抗体 是通过与HA2中非常保守的A螺旋结合，抑制了病毒的膜融合过程，发挥抗病毒功效，并且抗体轻链与病毒的中和效果无关[2-5]。因此，针对流感病毒蛋白HA的保守区，有望开发一种广谱的流感治疗用抗体。本专利技术基于对流感病毒蛋白HA保守区和CR6261的相互作用构效关系 [3-5]，采用计算机设计结合当今抗体生物信息学，设计出抗流感病毒蛋白HA保守区抗体片段序列，即VH和scFv序列，并在VH序列的基础上，设计和表达了VH抗体的三聚体等分子形式，获得新型广谱抗流感病毒蛋白HA保守区的小分子抗体。
技术实现思路
为了实现上述目的，本专利技术公开了针对流感病毒A保守区的VH和scFv两类抗体的氨基酸序列、核苷酸序列及其VH-trimer的不同分子结构，以及涉及这些流感抗体的制备方法及其用途。本专利技术公开了一种广谱结合流感病毒A的重组抗体，其特征在于它包含一组人源化重组流感病毒A 抗体片段；所述抗体片段包括重组形式 的VH、（VH）2、（VH）3、scFv、Fab、 Fab'、 F(ab')、IgG的形式。本专利技术所述抗体片段为融合其它蛋白质或多肽或小分子标记物的形式。其中所述重组单链抗体片段包含轻链、重链及一种结构柔性连接肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。所述重组抗体片段的单域重组抗体为只含重链可变区 (VH) , 无轻链可变区， 具有ID NO:3所示的氨基酸序列，具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。所述体重组抗体单域片段的重链可变区VH可与其他蛋白，如与异亮氨酸拉链(isoleucine-zipper)融合, 形成具有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列，具有SEQ ID NO:6所述的核苷酸序列。本专利技术所述抗体片段融合形成同源VH三聚体，VH三聚体指的是同源三条VH，通过异亮氨酸拉链形成非共价键的同源三聚体，它们之间的重量份数比为1：1：1。本专利技术所述的广谱结合流感病毒A的重组抗体，其特征在于所述抗体特异性结合到流感病毒A的血凝素上，其亲和力不低于10-7M。本专利技术进一步公开了一种药物组合物，它含有广谱结合流感病毒A的重组抗体及与抗体相容的药学上可接受的载体。包括肌内注射、静脉内注射或局部给药、透皮吸收给药、喷雾给药。本专利技术更进一步公开了广谱结合流感病毒A的重组抗体在制备作为治疗流感病毒A保守区的VH和scFv两类抗体药物中的应用。试验结果显示：（1）VH和scFv抗体针对流感病毒A抗原，如N5H1、N5H2等常见流感病毒抗原具有特异性结合力，其亲和力不低于10-7M。（2）VH抗体制备为三聚体后，对抗原的结合力提高了10倍。（3）VH抗体组装为scFv形式后，抗体更为稳定，对抗原的结合力达到10-10M。本专利技术公开的广谱结合流感病毒A的重组抗体也可以作为检测流感病毒A的试剂盒。本专利技术还提供了VH抗体三聚体（VH-trimer）形式。 此外，VH抗体和scFv抗体序列可开发的其他形式的重组抗体，所述VH和scFv抗体还可以是与其它蛋白质或多肽或小分子标记物的融合形式，如与Fc片段或PEG修饰的抗体本专利技术的抗体的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种简单可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。本专利技术优先VH和scFv抗体为合成方法制备目标基因序列。有关序列如下：SEQ ID NO：1 单链scFv抗体片段氨基酸序列EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCSGSSSNIGNDYVSWYQQKPGKAPKLLIYDNNKRPSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCATWDRRPTAYVVFGQGTKLTVLKRGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGGPFRSYAISWVRQAPGKGLEWVGGIIPIFGTTKYAPKFQGRFTISKDDFAGTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARHMGYQVRETMDVWGQGTLVTVSSHHHHHHLGGCDESEQ ID NO：2 单链scFv抗体片段核苷酸序列GAAATCGTTATGACCCAGTCTCCGTCTACCCTGTCTGCGTCTGTTGGTGACCGTGTTATC ATCACCTGCTCTGGTTCTTCTTCTAACATCGGTAACGACTACGTTTCTTGGTACCAGCAG AAACCGGGTAAAGCGCCGAAACTGCTGATCTACGACAACAACAAACGTCCGTCTGGTGTT CCGTCTCGTTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACCGAATTCACCCTGACCATCTCTTCTCTG CAGCCGGACGACTTCGCGACCTACTACTGCGCGACCTGGGACCGTCGTCCGACCGCGTAC GTTGTTTTCGGTCAGGGTACCAAACTGACCGTTCTGAAACGTGGTGGTGGTGGTGGTTCT GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGAAGTTCAGCTGGTT GAATCTGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGCACCGTTTCT GGTGGTCCGTTCCGTTCTTACGCGATCTCTTGGGTTCGTCAGGCGCCGGGTAAAGGTCTG GAATGGGTTGGTGGTATCATCCCGATCTTCGGTACCACCAAATACGCGCCGAAATTCCAG GGTCGTTTCACCATCTCTAAAGACGACTTCGCGGGTACCGTTTACCTGCAGATGAACTCT CTGCGTGCGGAAGACACCGCGGTTTAC本文档来自技高网...
【技术保护点】
广谱结合流感病毒A的重组抗体，其特征在于它包含一组人源化重组流感病毒A 抗体片段；所述抗体片段包括重组形式 的VH、（VH）2、（VH）3、scFv、Fab、 Fab'、 F(ab')、IgG的形式。
【技术特征摘要】
1.广谱结合流感病毒A的重组抗体，其特征在于它包含一组人源化重组流感病毒A 抗体片段；所述抗体片段包括重组形式 的VH、（VH）2、（VH）3、scFv、Fab、 Fab'、 F(ab')、IgG的形式。2.权利要求 1所述的广谱结合流感病毒A的重组抗体，其特征在于所述抗体片段为融合其它蛋白质或多肽或小分子标记物的形式。3.权利要求 1所述的广谱结合流感病毒A的重组抗体(scFv)，其特征在于所述重组单链抗体片段包含轻链、重链及一种结构柔性连接肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。4.权利要求1所述广谱结合流感病毒A的重组抗体，其特征在于所述重组抗体片段的单域重组抗体为只含重链可变区 (VH) , 无轻链可变区， 具有ID NO:3所示的氨基酸序列，具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。5.权利要求1所述的广谱结合流感病毒A的重组抗体，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：史晋海，余馨，何明跃，
申请(专利权)人：晋明天津生物医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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