TEM1特异性荧光探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种TEM1特异性荧光探针，其包括抗TEM1单链抗体、连接子MAL‑PEG‑NH

TEM1 specific fluorescent probes and their applications

The invention provides a TEM1 specific fluorescent probe, which comprises a single chain antibody against TEM1, MAL PEG NH connector

【技术实现步骤摘要】
TEM1特异性荧光探针及其应用
本专利技术涉及光学分子成像领域，具体涉及荧光探针领域，特别涉及一种TEM1特异性荧光探针及其应用。
技术介绍
近年来，光学成像以其非侵袭性、实时、分辨率高等优势广泛应用于肿瘤研究领域，可对肿瘤进行早期诊断，反映肿瘤解剖学结构及代谢情况。吲哚氰绿(IndoCyanineGreen，ICG)是最常见的传统的非特异性荧光探针，主要应用于临床的视网膜血管造影和肝脏功能测定。但是，ICG可以与大部分的清蛋白非特异性的结合，因此极大的限制了其在临床诊断中的作用。卵巢癌是一种女性生殖系统恶性肿瘤，死亡率高居妇科癌症首位，由于其发病隐蔽，临床症状、体征不典型，目前缺乏有效的早期诊断方法。新近发现肿瘤组织中存在肿瘤内皮细胞标志物(TEM)，其在正常组织中少量表达或不表达，能够成为良好的肿瘤标志物。研究证明内皮唾液酸蛋白(TEM1/endosialin/CD248)在卵巢癌组织中高表达，与体内其他器官差异明显。
技术实现思路
本专利技术提供了一种TEM1特异性荧光探针，其包括抗TEM1单链抗体、连接子MAL-PEG-NH2和荧光染料ICG-NHS，其中，所述荧光染料ICG-NHS通过酰胺键与连接子MAL-PEG-NH2连接，所述抗TEM1单链抗体的C末端为半胱氨酸，并通过硫醚键与连接子MAL-PEG-NH2连接。在本专利技术一个优选的实施方案中，所述抗TEM1单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术另一个优选的实施方案中，所述抗TEM1单链抗体由SEQIDNO.2所示的核酸序列编码。在本专利技术另一个优选的实施方案中，所述连接子MAL-PEG-NH2中，PEG分子量为10K。在本专利技术另一个优选的实施方案中，所述TEM1特异性荧光探针的亲和系数为6-10nM，优选7-9nM。本专利技术还提供了TEM1特异性荧光探针在制备诊断卵巢癌的试剂中的用途。本专利技术还提供了一种组合物，其包含所述的TEM1特异性荧光探针和药学上可接受的载体。本专利技术还提供了一种试剂盒，其包含所述的TEM1特异性荧光探针。本文所使用的术语“试剂盒”包括本专利技术的TEM1特异性荧光探针和使用说明书。该试剂盒能进一步包含至少一种另外的试剂。试剂盒通常包括一个标签，简要地说明了试剂盒内容的目的用途。本专利技术提供的TEM1特异性荧光探针特异性好，灵敏度高，无细胞毒性，由于抗TEM1单链抗体的分子量较小，其在血清中易于清除，并且免疫原性较小，在体内不易引发特异性反应；另外，本专利技术的TEM1特异性荧光探针还具有干扰小、穿透力强的优点，适于临床应用。附图说明图1为构建质粒的克隆验证的结果；图2为各表达菌株超声破碎后的SDS-PAGE结果；图3为不同批次复性的包涵体蛋白的SDS-PAGE结果；图4为ELISA检测抗TEM1单链抗体亲和力的结果；图5为78C-PEG-ICG合成示意图；图6为ELISA检测78C-PEG-ICG亲和力的结果；图7为流式细胞术检测78C-PEG-ICG特异性的结果；图8为流式细胞术检测78C-PEG-ICG内吞能力的结果；图9为78C-PEG-ICG内吞能力的统计学分析结果；图10为78C-PEG-ICG蛋白电泳检测的结果；图11为应用近红外成像检测78C-PEG-ICG的特异性和灵敏度的结果；图12为用78C-ICG、78C-PEG-ICG或IgG-ICG通过尾经脉注射小鼠48小时后的活体成像结果。具体实施方式下面将结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行描述，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1载体构建与抗TEM1单链抗体的表达、纯化与复性编码抗TEM1单链抗体的核酸其序列如SEQIDNO.2所示，3’末端是编码半胱氨酸(Cys)的密码子，用限制性内切酶NsiI/XhoI将其克隆到PET302载体上，构建成一个完整的质粒。将质粒转化大肠杆菌感受态细胞，铺板并过夜培养。待平板上长出菌落后提取质粒，用外源基因上的一个引物与载体上的另一个引物进行PCR，克隆验证的结果如图1所示，除了2号克隆没有特异性的条带之外，其他克隆均有特异性条带出现。测序结果也证明载体构建成功。将上述质粒转化大肠杆菌BL21D3，铺板并过夜培养。挑取单菌落，用5mlLB培养基重悬，并置于37℃培养过夜。按1:100的比例将上述5ml培养基转移到装有500mlLB培养基的烧瓶内，置于37℃摇床中培养2小时。按1:1000的比例加入IPTG诱导(计算得到IPTG终浓度为1mM)作为诱导组，设置未加IPTG的对照组，37℃培养2小时。4℃条件下以4000rpm的转速离心15分钟，收集菌体。用40mlEQ缓冲液洗涤一次，并用40ml含8M尿素的EQ缓冲液将菌体配成悬液。将菌体悬液的容器置于冰浴中，采用超声波破碎，设置功率40％，破碎时间1秒，间歇时间2秒，运行6分钟，超声后的对照组菌液作为诱导前总蛋白(Before)，超声后的诱导组菌液作为诱导后总蛋白(Total)。4℃条件下以最大转速离心15分钟，收集上清(Soluble)和菌体。分别取10μlBefore、Total和Soluble进行SDS-PAGE，结果见图2，可以看出Total里面有大量的诱导蛋白存在，而Soluble中却没有相应的蛋白，证明诱导蛋白以包涵体形式存在。因此按以下步骤进行包涵体纯化和复性。用PBS重悬菌体，加入3ml磁珠液(预先用10mlEQ缓冲液清洗磁珠)，4℃条件下结合2小时。用20ml含8M尿素的清洗液洗涤磁珠2次。用3ml含8M尿素的洗脱液洗涤2次，将目的蛋白78C洗脱下来。将2次洗涤后的洗脱液合并共6ml，用含8M尿素的EQ缓冲液定容至25ml。4℃条件下，将上述25ml悬液放置于1LPBS缓冲液中透析过夜。将不同批次复性的包涵体蛋白(1-12批)进行SDS-PAGE，上样量为5μl或10μl。结果见图3，可见蛋白纯度较高，几乎没有杂质存在。利用Millipore公司50ml浓缩管的对蛋白悬液浓缩离心，将蛋白浓度浓缩至1mg/ml。实施例2ELISA检测抗TEM1单链抗体的亲和力用2％明胶为96孔板铺板，每孔50μl。37℃下孵育30至60分钟。将MS1-TEM1细胞(转染了TEM1质粒能够高表达TEM1蛋白的小鼠胰岛内皮细胞)加入96孔板，每孔细胞数约为104-105。37℃培养过夜。利用PBS洗涤细胞3次。每孔加入合适浓度(0.0001nM、0.001nM、0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM、1mM、10mM)的抗TEM1单链抗体，4℃条件下孵育1小时。再次用PBS洗涤细胞3次。加入抗His-HRP二抗，4℃条件下孵育1小时。再次用PBS洗涤细胞3次。每孔加入100μlTMB液，37℃条件下孵育时间不超过30分钟。每孔加入100μl终止液，利用bioteck比色仪检测OD值。图4显示了抗TEM1单链抗体的亲和力检测结果，可见抗TEM1单链抗体具有极高的亲和力，亲和常数达到3.941nM。实施例3荧光染料ICG与抗TEM1单链抗体的结合(78C-PEG-ICG)文献报道ICG与抗体结合的时会出现淬灭的现象，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TEM1特异性荧光探针，其包括抗TEM1单链抗体、连接子MAL‑PEG‑NH

【技术特征摘要】
1.一种TEM1特异性荧光探针，其包括抗TEM1单链抗体、连接子MAL-PEG-NH2和荧光染料ICG-NHS，其中，所述荧光染料ICG-NHS通过酰胺键与连接子MAL-PEG-NH2连接，所述抗TEM1单链抗体的C末端为半胱氨酸，并通过硫醚键与连接子MAL-PEG-NH2连接。2.根据权利要求1所述的TEM1特异性荧光探针，所述抗TEM1单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的TEM1特异性荧光探针，所述抗TEM1单链抗体由SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦宇，鲍会静，徐晨，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：天津,12