一种荧光共振探针及其应用和试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种荧光共振探针及其应用和试剂盒，属于生物化学领域。本发明专利技术提供的荧光共振探针，适用于检测靶核酸片段，其包括能够与靶核酸片段形成T型结构的第一荧光探针和第二荧光探针，该T型结构可以确保第一荧光探针上的第一荧光基因和第二荧光探针上的第二荧光基因发生荧光共振能量转移。通过检测荧光共振能量转移效率实现对靶核酸片的定性或定量检测，该荧光共振探针具有较高的特异性和灵敏度，能够将碱基序列差异程度低至一个碱基的靶核酸片段检测出。

【技术实现步骤摘要】
一种荧光共振探针及其应用和试剂盒
本专利技术涉及生物化学领域，具体而言，涉及一种荧光共振探针及其应用和试剂盒。
技术介绍
目前，现有的用于检测微小RNA(miRNA)的方法主要有Northern印迹分析，微点阵分析和实时荧光定量聚合酶链式反应。其中，Northern印迹分析是基于杂交检测RNA的常用方法，它是最早用于微小RNA分析的几种方法之一。这种方法简单易行，大部分实验室都可以进行操作，不需要额外的资金投入与设备更新。微点阵分析也是基于杂交的原理来检测微小RNA，它通过测定特定过程中微小RNA的表达水平，来分析了解微小RNA的表达调控机制以及由微小RNA调控的基因的表达。微点阵分析采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交，通过荧光扫描获得表达图谱，借助相应软件进行miRNA的表达分析。由于在设计探针时可以包含所有可用miRNA序列，因此微点阵可以作到高通量的miRNA分析。实时荧光定量聚合酶链式反应通过扩增技术，是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。起始目标核酸的拷贝数越高，就越快观察到荧光强度的显著增加。但是，上述的现有检测方法无法清楚的区分出或者准确的检测出碱基序列差异程度很小(例如只有几个或一个碱基的差异程度)的miRNA片段或者是其他类型的RNA片段或DNA片段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种荧光共振探针，该荧光共振探针能够检测或区分出碱基序列差异程度很小(例如只有几个或一个碱基的差异程度)的靶核酸片段，其具有较高的特异性和灵敏度。本专利技术的另一目的在于提供上述荧光共振探针在检测靶核酸片段中的应用。本专利技术的另一目的在于提供上述荧光共振探针在制备靶核酸片段检测试剂盒中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种包括上述的荧光共振探针的试剂盒。本专利技术是这样实现的：一种荧光共振探针，适于检测靶核酸片段，其包括第一荧光探针和第二荧光探针，第一荧光探针具有第一结合区和第一识别区，第二荧光探针具有第二结合区和第二识别区，第一结合区与第二结合区反向互补，第一结合区的末端标记有第一荧光基团，第二结合区的末端标记有第二荧光基因，第一荧光基因的荧光光谱与第二荧光基团的激发光谱重叠，第一识别区和第二识别区分别与靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区反向互补。上述的荧光共振探针在检测靶核酸片段中的应用。上述的荧光共振探针在制备用于试剂盒中的应用。一种试剂盒，其包括上述的荧光共振探针。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的提供的荧光共振探针包括第一荧光探针和第二荧光探针。第一荧光探针具有与靶核酸片段的第一靶标区反向互补的第一识别区，第二荧光探针具有与靶核酸片段的第二靶标区反向互补的第二识别区。在检测时，如果待测样品中存在靶核酸片段，则第一荧光探针的第一识别区和第二荧光探针的第二识别区分别与靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区通过碱基互补配对结合；同时，第一结合区与和第二结合区通过碱基补配对结合。这样，靶核酸片段、第一荧光探针以及第二荧光探针三者形成一个T型结构，稳定状态的T型结构能够使得第一荧光探针上的第一荧光基团和第二荧光探针上的第二荧光基因的距离变短，该距离能够保证第一荧光基因和第二荧光基团之间发生荧光共振能量转移。而该T型结构只有在第一识别区和第二识别区与靶核酸片段的相应靶标区的碱基完全互补配对结合的情况下才稳定(只要有一个碱基不能互补配对，T型结构都不稳定，不能保证发生荧光共振能量转移)。这样，通过激发第一荧光基因则可检测到第二荧光基因的荧光发射信号，再根据荧光共振能量转移效率，实现对碱基序列差异程度很小的靶核酸片段的检测目的，以及通过对荧光共振能量转移效率的计算，还可以实现对靶核酸片段的定性或定量检测。因此，本专利技术提供的荧光共振探针基于一种全新的检测原理，其不仅能够实现对靶核酸片段的定性或定量检测，还能够将靶核酸片段从数量或类型众多的且碱基序列差异很小的核酸片段中检测出来，该碱基序列差异可低至只有一个碱基的差异，具有较高的特异性和灵敏度，并且其可适用于检测各种类型的DNA和RNA尤其是miRNA，也可适用于制备试剂盒，具有非常广阔的应用前景和市场价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术提供的荧光共振探针的检测原理示意图；图2为本专利技术提供的实验例1的荧光光谱检测结果图；图3为本专利技术提供的实验例2的荧光共振能量转移效率检测结果图；图4为本专利技术提供的实验例3的荧光共振能量转移效率检测结果图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术提供的一种荧光共振探针及其应用和试剂盒进行具体说明。一方面，本专利技术提供了一种荧光共振探针，其适于检测核酸片段，其包括第一荧光探针和第二荧光探针。第一荧光探针具有第一结合区和第一识别区。容易理解到，第一结合区和第一识别区相连接。第二荧光探针具有第二结合区和第二识别区。容易理解到，第二结合区和第二识别区相连接。第一结合区与第二结合区反向互补，第一结合区的末端标记有第一荧光基团(也可以理解为第一荧光基因标记在第一结合区远离第一识别区的一端)，第二结合区的末端标记有第二荧光基因(也可以理解为第二荧光基因标记在第二结合区远离第二识别区的一端)。第一荧光基因的荧光光谱与第二荧光基团的激发光谱重叠。第一识别区和第二识别区分别与靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区反向互补。本专利技术提供的荧光共振探针的检测原理(如图1所示)大致如下：首先，第一荧光基因和第二荧光基团各自均具有激发光谱和荧光光谱，且第一荧光基因的荧光光谱与第二荧光基团的激发光谱重叠。当二者的距离足够靠近时，用第一荧光基因的激发光谱的激发光激发第一荧光基因，第一荧光基团产生的荧光可以激发第二荧光基因产生荧光，则可以检测到第二荧光基因的荧光发射信号，即发生了荧光共振能量转移(FRET)，其中，第一荧光基因为荧光共振能量供体，第二荧光基团为荧光共振能量受体。而第一荧光基因和第二荧光基因的之间的距离是荧光共振能量转移发生的重要因素。基于上述原理，在检测时，将第一荧光探针、第二荧光探针以及待测样品加入到杂交液是进行杂交反应，如果待测样品中存在靶核酸片段，则第一荧光探针的第一识别区和第二荧光探针的第二识别区分别与靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区通过碱基互补配对结合(第一识别区和第二识别区分别与靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区反向互补)。同时，第一结合区与和第二结合区通过碱基互补配对结合(第一结合区与第二结合区反向互补)。这样，靶核酸片段、第一荧光探针以及第二荧光探针形成一个T型结构(如图1所示，图1中的最右侧为形成的T型结构，箭头代表荧光共振能量的转移方向)。该T型结构能够使得第一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光共振探针，适于检测靶核酸片段，其特征在于，其包括第一荧光探针和第二荧光探针，所述第一荧光探针具有第一结合区和第一识别区，所述第二荧光探针具有第二结合区和第二识别区，所述第一结合区与所述第二结合区反向互补，所述第一结合区的末端标记有第一荧光基团，所述第二结合区的末端标记有第二荧光基因，所述第一荧光基因的荧光光谱与所述第二荧光基团的激发光谱重叠，所述第一识别区和所述第二识别区分别与所述靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区反向互补。

【技术特征摘要】
1.一种荧光共振探针，适于检测靶核酸片段，其特征在于，其包括第一荧光探针和第二荧光探针，所述第一荧光探针具有第一结合区和第一识别区，所述第二荧光探针具有第二结合区和第二识别区，所述第一结合区与所述第二结合区反向互补，所述第一结合区的末端标记有第一荧光基团，所述第二结合区的末端标记有第二荧光基因，所述第一荧光基因的荧光光谱与所述第二荧光基团的激发光谱重叠，所述第一识别区和所述第二识别区分别与所述靶核酸片段上相邻的第一靶标区和第二靶标区反向互补。2.根据权利要求1所述的荧光共振探针，其特征在于，所述第一结合区的长度为7-9bp。3.根据权利要求1所述的荧光共振探针，其特征在于，所述第一识别区的长度为10-12bp，所述第二识别区的长度为10-12bp。4.根据权利要求1-3中任一项所述的荧光共振探针，其特征在于，所述第一荧光基团为Cy3，所述第二荧光基团为Cy5；或者，所述第一荧光基团为Cy5，所述第二荧光基团为Cy5.5；或者，所述第一荧光基团为CFP或GFP，所述第二荧光基团为YFP；或者，所述第一荧光基团为Rluc，所述第二荧光基团为QDs...

【专利技术属性】
技术研发人员：金宗文，罗擎颖，刘琳，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44