多肽探针、包含该探针的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种多肽探针、包含该探针的试剂盒及其应用。所述多肽探针选自下列物质及其二聚体的组合物：X1‑Y1‑CC；其中，X1为具有二聚化能力的多肽；Y1选自待检测酶的酶切位点序列。该探针充分利用双砷染料‑四半胱氨酸标签复合物的稳定性和量子产率极度依赖于四半胱氨酸标签空间构象这一特性，进而发展了一种简单、灵敏测定酶活性的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种多肽探针、包含该探针的试剂盒及其应用。
技术介绍
细胞凋亡是一种由基因控制的细胞主动死亡过程，对多细胞生物个体的发育、正常细胞更新、组织保持正常结构与功能有着积极而重要的意义，异常细胞凋亡则会导致肿瘤、神经退行性疾病等疾病的发生。细胞凋亡的实施是由一系列半胱氨酸蛋白酶所引发的级联反应来实现的(ColdSpringHarb.Perspect.Biol.,2013,5(4):a008656)，在半胱氨酸蛋白酶家族中，半胱氨酸蛋白酶-3属于效应型凋亡酶，激活的半胱氨酸蛋白酶-3可降解一系列底物，包括凋亡抑制物、细胞外基质与骨架蛋白以及DNA修复相关因子，使细胞生化以及形态学发生改变，导致细胞凋亡(Oncogene,2008,27(48):6194-6206)。半胱氨酸蛋白酶-3是细胞凋亡执行阶段的关键蛋白酶，因此可以通过测定半胱氨酸蛋白酶-3的活性来测定细胞凋亡过程。双砷染料-四半胱氨酸标签体系是一种具有广阔应用前景的活细胞蛋白荧光标记方法(Science,1998,281(5374):269-272)。在该系统中，四半胱氨酸标签是一个包含四个半胱氨酸残基的六肽或十二肽(Nat.biotechnol.,2005,23(10):1308-1314)，半胱氨酸残基两两结合在一起，形成半胱氨酸-半胱氨酸二联子，这两个二联子被脯氨酸-甘氨酸二联子分隔开来。四半胱氨酸标签对双砷染料具有较高的特异性和亲和力。双砷染料在被1,2-乙二硫醇螯合的情况下不发荧光，但是一旦与四半胱氨酸标签结合就会发出很强的荧光。除了以线性方式存在外，四半胱氨酸标签中的两个半胱氨酸-半胱氨酸二联子还可以被分离开来，但是它们在空间上必须相临近(Nat.Chem.Biol.,2007,3(12):779-784)。在该标记系统中，四半胱氨酸标签的空间构象会对所形成双砷染料-四半胱氨酸标签复合物的稳定性和量子产率产生极大的影响(J.Am.Chem.Soc.,2002,124(21):6063-6076)。半胱氨酸蛋白酶-3通常以无活性的酶原存在细胞中，需要被上游的激活型凋亡酶切割而得以活化。激活的半胱氨酸蛋白酶-3可以特异性切割天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸四肽序列，根据这一特性，一系列基于天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸的探针被开发出来用于测定半胱氨酸蛋白酶-3的活性，对应的方法有荧光检测法、电化学法、比色法、表面等离子体共振法、生物发光法、电致化学发光法。随着纳米技术的发展，一些基于纳米材料的多肽探针如量子点复合多肽探针、纳米金复合多肽探针、石墨烯复合多肽探针也被开发出来用于测定半胱氨酸蛋白酶-3的活性(Chem.rev.,2015,115(22):12546-12629)。此外，一些基于荧光共振能量转移反应的蛋白探针以及荧光开关(Nat.Commun.,2013；，4:2157)也被开发出来用于测定细胞内半胱氨酸蛋白酶-3的活性。在这些方法中，荧光标记会在一定程度上降低半胱氨酸蛋白酶-3对底物的切割效率，制备纳米传感器则使得检测过程变得复杂和低效。因此迫切需要发展简单、灵敏、高效的方法来测定细胞内半胱氨酸蛋白酶-3活性从而来检测细胞凋亡过程。此外，本领域在检测其它酶的活性时也或多或少的存在上述问题，且缺乏一种高效的可针对各种酶的活性进行检测的技术。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
在本专利技术中，我们充分利用双砷染料-四半胱氨酸标签复合物的稳定性和量子产率极度依赖于四半胱氨酸标签空间构象这一特性，设计了一种新型无标记多肽分子探针，进而发展了一种简单、灵敏测定酶活性的方法。在描述本专利技术的化合物、组合物、蛋白质、肽等以及方法之前，应当理解，这些实施方式不限于所描述的特定方法、方案以及试剂，这是因为它们可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方式目的，并且不旨在限制本实施方式或权利要求的范围。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种多肽探针，所述多肽探针选自下列物质及其二聚体的组合物：X1-Y1-CC；其中，X1为具有二聚化能力的多肽；Y1选自待检测酶的酶切位点序列。其中，X1段形成的二聚体可自发形成，也可在其它辅助蛋白或辅助条件下形成(例如X1段某些氨基酸残基被修饰或肽段处于疏水环境中)，优选的，所述二聚体为自发形成。该探针包含有至少三个不同的功能区域，CC即两个半胱氨酸，是与双砷染料结合的部位，用来读取待检测酶的活性。在没有被待检测酶切割的时候，多肽探针之间的(自发)二聚化会使得两个半胱氨酸-半胱氨酸二联子在空间上相互接近，从而能与双砷染料结合发出较强的荧光；相反，待检测酶的酶解作用会将半胱氨酸-半胱氨酸二联子从多肽中解离下来，虽然被切割的多肽依然能够二聚，但却缺少了锚定双砷染料的部位，双砷染料因而不能发光。因此，通过测定切割前后荧光的变化，可以定量测定待检测酶的活性。通过更改Y1段多肽的序列，理论上本专利技术提供的探针可对所有具有切割肽段能力的酶的活性进行检测。优选的，如上所述的多肽探针，所述X1的全部或部分氨基酸序列选自D构型氨基酸。由于在生物进化过程中，氨基酸自然选择为L型，生物体内的酶无法识别并切割D构型氨基酸。此设计可防止X1区段被其它蛋白酶非特异性切割，也能有效延长本专利技术提供的多肽探针的半衰期。X1区段中D构型和L构型的氨基酸可交叉排列，例如一个D构型一个L构型交替相接，也可以起到上述作用；最优选的，X1的氨基酸序列全部选自D构型氨基酸。优选的，如上所述的多肽探针，所述X1为亮氨酸拉链，或包含亮氨酸拉链结构的多肽。亮氨酸拉链是一种作为二聚体化结构域的超二级结构，且使相互平行的α-螺旋之间产生粘附力。一个亮氨酸拉链包含了多个亮氨酸残基，通常每七个氨基酸残基就出现一次，这形成了一条两性的α-螺旋，疏水区只在其中一侧。这个疏水区提供了二聚化的区域，使得基序可以像“拉链”一样拉起来。除此之外，根据本专利技术提供的
技术实现思路
的启示，X1段多肽可根据生物中常见的蛋白二聚体中负责二聚化的蛋白区段进行设计，例如受体酪氨酸激酶、某些核受体蛋白、14-3-3蛋白、驱动蛋白、FactorXI、FactorXIII、Toll样受体、纤维原蛋白、G蛋白的βγ亚基二聚体等等，这对本领域技术人员是容易的。亮氨酸拉链仅作为最优选的技术方案。优选的，X1段多肽可选自下述氨基酸序列：QLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVG；KLEALEGKLEAEGKGKLEAUGICLEALE；GEIAALKQEIAALKKENAALKWEIAALKQGYY；ASIARLEEKVKTLKAQNYELASTANMLREQVAQLGAP；ASAAELEERVKTLKAEIYELQSEANMLREQIAQLGAP；ASAAELEERVKTLKAEIYELQSEANMLREQGAP；ASAAELEERVKTLKAEIYELQSEGAP；ESKVSSLESKVSSLESKVSSLESKVSSLESKVSSLESKVSS。更优选的，上述氨基酸序列均为D构型氨基酸。优选的，如上所述的多肽探针，所述多肽探针的N端进行了乙酰化修饰；和/或；所述多肽探针的C端进行了酰胺化修饰。多肽探针两端的修饰可起到增加探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽探针，其特征在于，所述多肽探针选自下列物质及其二聚体的组合物：X1‑Y1‑CC；其中，X1为具有二聚化能力的多肽；优选的，所述二聚体为自发形成；优选的，所述X1的全部或部分氨基酸序列选自D构型氨基酸；优选的，所述X1为亮氨酸拉链，或包含亮氨酸拉链结构的多肽；Y1选自待检测酶的酶切位点序列；优选的，所述多肽探针的N端进行了乙酰化修饰；和/或；所述多肽探针的C端进行了酰胺化修饰。

【技术特征摘要】
1.一种多肽探针，其特征在于，所述多肽探针选自下列物质及其二聚体的组合物：X1-Y1-CC；其中，X1为具有二聚化能力的多肽；优选的，所述二聚体为自发形成；优选的，所述X1的全部或部分氨基酸序列选自D构型氨基酸；优选的，所述X1为亮氨酸拉链，或包含亮氨酸拉链结构的多肽；Y1选自待检测酶的酶切位点序列；优选的，所述多肽探针的N端进行了乙酰化修饰；和/或；所述多肽探针的C端进行了酰胺化修饰。2.根据权利要求1所述的多肽探针，其特征在于，所述X1与所述Y1之间还包括Linker1和/或所述Y1与所述CC之间还包括Linker2；优选的，所述Linker1的氨基酸数目为1～5个；优选的，所述Linker2的氨基酸数目为1～5个。3.根据权利要求1或2所述的多肽探针，其特征在于，所述Y1的序列为DEVD。4.根据权利要求3所述的多肽探针，其特征在于，所述X1的氨基酸序列为D构型的asaaeleervktlkaeiyelrskanmlreqiaqlgap。5.根据权利要求3所述的多肽探针，其特征在于，所述Linker2的氨基酸序列为G。6.一种诊断试剂盒，其包括权利要求1～5任一项所述的多肽探针、双砷染料、待检测酶切割所述多肽探针得到酶切产物时所用的缓冲液1以及所述双砷染料对所述酶切产物进行标记时所用的缓冲液2；优选的，所述缓冲液1为含有用于避免二硫键出现的还原剂，更优选的，所述还原剂选自二硫苏糖醇和/或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐；最优选的，所述还原剂选自二硫苏糖醇，且所述还原剂的浓度为0.5～2mM；优选的，所述缓冲液2为含有用于避免单个所述CC片段与所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨用，梁岩，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44