TEM1特异性核磁探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种TEM1特异性核磁探针，其包括通过交联剂连接的抗TEM1单链抗体和氨基化的SPIO纳米颗粒，其中，所述氨基化的SPIO纳米颗粒通过酰胺键与交联剂连接，所述抗TEM1单链抗体的C末端为半胱氨酸，并通过硫醚键与交联剂连接。本发明专利技术还提供了一种TEM1特异性核磁探针的制备方法，TEM1特异性核磁探针在制备诊断卵巢癌的试剂中的用途以及包含该TEM1特异性核磁探针的试剂盒。本发明专利技术提供的TEM1特异性核磁探针特异性好，灵敏度高，无细胞毒性，在血清中易于清除，并且免疫原性较小，在体内不易引发特异性反应；另外，抗体分子量较小使其易进入实体瘤周边，并且与受体的结合效率很高，能够获得足够的影像对比度。

【技术实现步骤摘要】
TEM1特异性核磁探针及其应用
本专利技术涉及分子影像学领域，具体涉及核磁探针领域，特别涉及一种TEM1特异性核磁探针及其应用。
技术介绍
卵巢癌是一种女性生殖系统恶性肿瘤，死亡率高居妇科癌症首位，由于其发病隐蔽，临床症状、体征不典型，目前缺乏有效的早期诊断方法。超声检查是探查卵巢癌最常用的方法，准确率高于CT，但成像影响因素较多，如患者体型、腹壁厚薄、肿块位置深浅、腹水影响等，且常和肠腔混淆，易出现漏诊。CT对卵巢肿瘤的定位诊断较好，但除了在诊断囊性畸胎瘤方面准确度高以外，对于其他卵巢肿瘤的良、恶性鉴别准确度低于B超。MRI(核磁共振成像)是非损伤性、非辐射性成像方法，但MRI是非特异性的，同时受到磁性纳米颗粒大小的影响，而使结果不稳定。新近发现肿瘤组织中存在肿瘤内皮细胞标志物(TEM)，其在正常组织中少量表达或不表达，能够成为良好的肿瘤标志物。研究证明内皮唾液酸蛋白(TEM1/endosialin/CD248)在卵巢癌组织中高表达，与体内其他器官差异明显。分子影像探针是现代生物影像技术发展的一个重要领域，该技术的核心是具有细胞靶向功能的不同种类和大小的分子探针，包括蛋白、抗体、多肽、化学小分子等。抗体靶向技术在肿瘤检测领域的应用越来越受到重视。然而，抗体由于其分子量大，一方面，在血清中不易被清除，且抗体作为外源性蛋白其免疫原性较大，在体内易引发特异性反应；另一方面，抗体分子量大导致其不易进入实体瘤周边，影响它们与受体的结合效率，难以获得足够的影像对比度。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种TEM1特异性核磁探针，其包括通过交联剂连接的抗TEM1单链抗体和氨基化的SPIO(超顺磁氧化铁)纳米颗粒，其中，所述氨基化的SPIO纳米颗粒通过酰胺键与交联剂连接，所述抗TEM1单链抗体的C末端为半胱氨酸，并通过硫醚键与交联剂连接。在本专利技术一个优选的实施方案中，所述抗TEM1单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术另一个优选的实施方案中，所述抗TEM1单链抗体由SEQIDNO.2所示的核酸序列编码。本专利技术的编码抗TEM1单链抗体的核酸，可以根据其序列通过现有技术已知的方法合成，如固相亚磷酸酰胺法等。在本专利技术另一个优选的实施方案中，氨基化的SPIO纳米颗粒粒径为60-120nm，优选为70-90nm。在本专利技术另一个优选的实施方案中，氨基化的SPIO纳米颗粒的横向弛豫率为70-90mM-1S-1。在本专利技术另一个优选的实施方案中，所述交联剂是SMCC或sulfo-SMCC。在本专利技术另一个优选的实施方案中，所述TEM1特异性核磁探针含有的铁离子的浓度为0.15-2.2nM，优选0.5-2nM，更优选1-1.5nM。本专利技术还提供了一种TEM1特异性核磁探针的制备方法，其包括以下步骤：(1)合成C末端为半胱氨酸的抗TEM1单链抗体，然后进行纯化及复性；(2)合成氨基化的SPIO纳米颗粒；(3)通过交联剂连接抗TEM1单链抗体和氨基化的SPIO纳米颗粒。本专利技术还提供了TEM1特异性核磁探针在制备诊断卵巢癌的试剂中的用途。本专利技术还提供了一种试剂盒，其包含TEM1特异性核磁探针。本文所使用的术语“试剂盒”包括本专利技术的TEM1特异性核磁探针和使用说明书。该试剂盒能进一步包含至少一种另外的试剂。试剂盒通常包括一个标签，简要地说明了试剂盒内容的目的用途。本专利技术提供的TEM1特异性核磁探针特异性好，灵敏度高，无细胞毒性，由于抗TEM1单链抗体的分子量较小，其在血清中易于清除，并且免疫原性较小，在体内不易引发特异性反应；另外，抗体分子量较小使其易进入实体瘤周边，并且与受体的结合效率很高，能够获得足够的影像对比度。附图说明图1为构建质粒的克隆验证的结果；图2为各表达菌株超声破碎后的SDS-PAGE结果；图3为不同批次复性的包涵体蛋白的SDS-PAGE结果；图4为抗TEM1单链抗体的亲和力检测结果；图5为氨基化的SPIO纳米颗粒的粒径的DLS测量结果；图6为氨基化的SPIO纳米颗粒的横向弛豫率的测量结果；图7为用Bradford蛋白测定试剂盒建立的检测NP-linker-78C浓度的标准曲线；图8为NP-linker-78C饱和曲线的检测的结果；图9为NP-linker-78C的毒性检测的结果；图10为NP-linker-78C的亲和力检测的结果；图11为NP-linker-78C的特异性检测的结果；图12为NP-linker-78C的内吞能力检测的结果；图13为NP-linker-78C的内吞实验的统计学分析结果；图14为荧光共聚焦的方法验证NP-linker-78C具有内吞的效果；图15为NP-linker-78C特异性结合抗原的MRI扫描结果；图16为NP-linker-78C的特异性结合抗原能力的统计学分析结果。具体实施方式下面将结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行描述，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1载体构建与抗TEM1单链抗体的表达、纯化与复性编码抗TEM1单链抗体的核酸其序列如SEQIDNO.2所示，3’末端是编码半胱氨酸(Cys)的密码子，用限制性内切酶NsiI/XhoI将其克隆到PET302载体上，构建成一个完整的质粒。将质粒转化大肠杆菌感受态细胞，铺板并过夜培养。待平板上长出菌落后提取质粒，用外源基因上的一个引物与载体上的另一个引物进行PCR，克隆验证的结果如图1所示，除了2号克隆没有特异性的条带之外，其他克隆均有特异性条带出现。测序结果也证明载体构建成功。将上述质粒转化大肠杆菌BL21D3，铺板并过夜培养。挑取单菌落，用5mlLB培养基重悬，并置于37℃培养过夜。按1:100的比例将上述5ml培养基转移到装有500mlLB培养基的烧瓶内，置于37℃摇床中培养2小时。按1:1000的比例加入IPTG诱导(计算得到IPTG终浓度为1mM)作为诱导组，设置未加IPTG的对照组，37℃培养2小时。4℃条件下以4000rpm的转速离心15分钟，收集菌体。用40mlEQ缓冲液洗涤一次，并用40ml含8M尿素的EQ缓冲液将菌体配成悬液。将菌体悬液的容器置于冰浴中，采用超声波破碎，设置功率40％，破碎时间1秒，间歇时间2秒，运行6分钟，超声后的对照组菌液作为诱导前蛋白，超声后的诱导组菌液作为诱导后总蛋白。4℃条件下以最大转速离心15分钟，收集上清(诱导后可溶性蛋白)和菌体。分别取10μl诱导前蛋白、诱导后总蛋白和诱导后可溶性蛋白进行SDS-PAGE，结果见图2，可以看出诱导后总蛋白里面有大量的诱导蛋白存在，而诱导后可溶性蛋白中却没有相应的诱导蛋白，证明诱导蛋白以包涵体形式存在。因此按以下步骤进行包涵体纯化和复性。用PBS重悬菌体，加入3ml磁珠液(预先用10mlEQ缓冲液清洗磁珠)，4℃条件下结合2小时。用20ml含8M尿素的清洗液洗涤磁珠2次。用3ml含8M尿素的洗脱液洗涤2次，将目的蛋白78C洗脱下来。将2次洗涤后的洗脱液合并共6ml，用含8M尿素的EQ缓冲液定容至25ml。4℃条件下，将上述25ml悬液放置于1LPBS缓冲液中透析过夜。将不同批次复性的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TEM1特异性核磁探针，其包括通过交联剂连接的抗TEM1单链抗体和氨基化的SPIO纳米颗粒，其中，所述氨基化的SPIO纳米颗粒通过酰胺键与交联剂连接，所述抗TEM1单链抗体的C末端为半胱氨酸，并通过硫醚键与交联剂连接。

【技术特征摘要】
1.一种TEM1特异性核磁探针，其包括通过交联剂连接的抗TEM1单链抗体和氨基化的SPIO纳米颗粒，其中，所述氨基化的SPIO纳米颗粒通过酰胺键与交联剂连接，所述抗TEM1单链抗体的C末端为半胱氨酸，并通过硫醚键与交联剂连接。2.根据权利要求1所述的TEM1特异性核磁探针，所述抗TEM1单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的TEM1特异性核磁探针，所述抗TEM1单链抗体由SEQIDNO.2所示的核酸序列编码。4.根据权利要求1所述的TEM1特异性核磁探针，其中氨基化的SPIO纳米颗粒粒径为60-120nm，优选为70-90nm。5.根据权利要求1所述的TEM1特异性核磁探针，其中氨基化的SPIO纳米颗粒的横向弛豫率为70-90...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍会静，徐晨，秦宇，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：天津,12