【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学，具体涉及一种camp荧光探针g-flamp2和g-flamp2b及其应用和试剂盒。
技术介绍
1、环磷酸腺苷(camp)是目前最大药物靶标g蛋白偶联受体(gpcr)家族的下游信使分子，细胞及活体水平的camp荧光成像是gpcr信号通路的基础研究和药物开发的重要方向。camp荧光探针主要分为基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针及基于单个荧光蛋白的探针，后者动态范围较前者大且使用简单。目前基于单个荧光蛋白的camp探针分为绿色和红色2小类，前者主要有flamindo2、caddis、campr和g-flamp1，后者主要有pink flamindo、red caddis、r-flinca、r-flamp1m和r-flamp2m。
2、活细胞中camp荧光成像是指将camp荧光探针表达在细胞中，然后利用荧光显微镜检测探针荧光的强度变化。荧光探针是camp荧光成像分析的关键。近几年，国际上知名实验室利用不同荧光蛋白、不同camp感应模块及不同的融合位点，开发了不同性能和光谱的camp单荧光蛋白探针，包括tetsuya kitaguchi博士开发的flamindo/flamindo2/pinkflamindo探针、anne marie quinn博士开发的caddis/red caddis探针、kazuki horikawa博士开发的r-flinca探针及justin blau博士开发的campr探针。对于绿色camp探针，申请人已开发更高性能的探针g-flamp1(cn201911251920.x和cn
3、综上，开发高性能的绿色camp荧光探针，提高其在实际应用中的亮度和动态范围，对于提高探测灵敏度和多色成像具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服上述技术问题，提供一种动态范围大、荧光亮度高、检测灵敏度高，可检测细胞受刺激后camp浓度改变，可与已有的其他荧光波段(如红色)探针或者红光敏感的工具蛋白联合使用，同时进行双色成像或者进行光学控制/荧光成像联用的camp荧光探针g-flamp2和g-flamp2b及其应用和试剂盒。
2、本专利技术的目的在于提供一种动态范围较大、荧光亮度高，可检测细胞受刺激后camp浓度改变，可与已有的其他荧光波段(如红色)探针或者红光敏感的工具蛋白联合使用，同时进行双色成像或者进行光学控制/荧光成像联用的camp荧光探针g-flamp2b及其应用和试剂盒。
3、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下。
4、第一方面，本专利技术提供一种camp荧光探针g-flamp2和g-flamp2b，所述的g-flamp2的氨基酸序列如seq id no：1所示；
5、所述的g-flamp2b的氨基酸序列如seq id no:2所示。
6、进一步的，所述的荧光探针g-flamp2和g-flamp2b最佳的单光子的激发波长为440±10nm。
7、进一步的，所述的荧光探针g-flamp2和g-flamp2b最佳的双光子的激发波长为900～940nm。
8、第二方面，本专利技术提供一种camp荧光探针r-flamp2和g-flamp2b的制备方法。
9、一种camp荧光探针g-flamp2的制备方法为：对g-flamp1的氨基酸进行如下突变：k118n，k126e，s207r，t248s，e316v，i333t，得到g-flamp2探针；
10、g-flamp2的氨基酸序列如seq id no：1所示。
11、一种camp荧光探针g-flamp2b的制备方法为：对g-flamp1的氨基酸进行如下突变：g42e，g61d，v66d，k118n，k126e，f183y，s207r，t248s，e316v，i333t，r350n，v351s，e355k，s378i，得到g-flamp2b探针。
12、g-flamp2b的氨基酸序列如seq id no：2所示。
13、第三方面，本专利技术提供一种camp荧光探针g-flamp2或g-flamp2b在检测camp中的应用。
14、第四方面，本专利技术提供一种camp荧光探针g-flamp2或g-flamp2b在活细胞和/或动物活体中检测camp中的应用。
15、第五方面，本专利技术提供一种荧光探针g-flamp2和g-flamp2b的试剂盒。
16、第六方面，本专利技术提供一种活细胞中camp荧光成像检测方法。
17、一种活细胞中camp荧光成像检测方法包括以下步骤：
18、(1)活细胞培养，细胞密度约50％-80％时，转染g-flamp2或g-flamp2b质粒；
19、(2)转染后的细胞培养过夜，饥饿细胞2～4小时后，将培养基换为无色透明的活细胞荧光成像缓冲液；
20、(3)单光子的激发波长440±10nm下，荧光显微镜成像分析。
21、第七方面，本专利技术提供一种哺乳动物细胞中camp荧光成像检测方法。
22、一种哺乳动物细胞中camp荧光成像检测方法包括以下步骤：
23、(1)哺乳动物细胞培养，培养基为含10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycin的dmem培养液，培养温度为37℃，co2含量为5％；
24、细胞密度约50％-80％时，转染g-flamp2或g-flamp2b质粒；
25、(2)转染后的哺乳动物细胞培养过夜，用不含血清和酚红的培养基饥饿细胞2～4小时后，将培养基换为无色透明的活细胞荧光成像缓冲液；
26、(3)单光子的激发波长440±10nm，荧光显微镜成像分析，成像频率为15s/frame(15秒每帧)，在第十帧加入forskolin，至forskolin终浓度60μm，检测g-flamp2或g-flamp2b探针荧光的强度变化。
27、本专利技术提供的荧光探针g-flamp2，是g-flamp1的氨基酸进行如下突变获得的：k118n，k126e，s207r，t248s，e316v，i333t，在37℃生理温度培养哺乳动物细胞中，亮度较g-flamp1提高60％，动态范围(δf/f0)为12。g-flamp2的δf/f0要高于g-flamp1的δf/f0(～10)，为动态范围最大的camp绿色荧光探针。因此，该探针在同等表达量下，荧光亮度更高，响应幅度更大，即灵敏度更高。本专利技术提供的荧光探针g-flamp2为绿色camp探针，最适单光子的激发波长为440±10nm，最适双光子的激发波长为900～940nm。荧光探针g-flamp2是绿色探针，能够与已有的大量红色探针或者其他工具蛋白联合使用，可同时进行双色成像或者进行光学控制/荧光成像联用。将本专利技术提供的荧光探针g-flamp2表达在哺乳动物细胞中，利用普通的荧光显微镜，即可检测细胞受特定刺激后camp浓度改本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种cAMP荧光探针G-Flamp2和G-Flamp2b，其特征在于：所述的G-Flamp2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
2.根据权利要求1所述的一种cAMP荧光探针G-Flamp2和G-Flamp2b，其特征在于：所述的荧光探针G-Flamp2及G-Flamp2b最佳的单光子的激发波长为440±10nm。
3.根据权利要求1或2所述的一种cAMP荧光探针G-Flamp2和G-Flamp2b，其特征在于：所述的荧光探针G-Flamp2及G-Flamp2b最佳的双光子的激发波长为900～940nm。
4.一种cAMP荧光探针G-Flamp2和G-Flamp2b的制备方法，其特征在于，所述的方法为：对G-Flamp1的氨基酸进行如下突变：K118N,K126E,S207R,T248S,E316V,I333T，得到G-Flamp2探针；
5.一种cAMP荧光探针G-Flamp2和G-Flamp2b在检测cAMP中的应用。
6.一种cAMP荧光探针G-Flamp2和G-Flamp2b在活细胞和/或动物活体中检测
7.一种包含权利要求1～4任意一项所述的荧光探针G-Flamp2和G-Flamp2b的试剂盒。
8.一种活细胞中cAMP荧光成像检测方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
9.一种哺乳动物细胞中cAMP荧光成像检测方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种camp荧光探针g-flamp2和g-flamp2b，其特征在于：所述的g-flamp2的氨基酸序列如seq id no:1所示；
2.根据权利要求1所述的一种camp荧光探针g-flamp2和g-flamp2b，其特征在于：所述的荧光探针g-flamp2及g-flamp2b最佳的单光子的激发波长为440±10nm。
3.根据权利要求1或2所述的一种camp荧光探针g-flamp2和g-flamp2b，其特征在于：所述的荧光探针g-flamp2及g-flamp2b最佳的双光子的激发波长为900～940nm。
4.一种camp荧光探针g-flamp2和g-flamp2b的制备方法，其特征在于，所述的方法为：...
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