一种检测人CIRBP的ELISA试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医学人CIRBP单克隆抗体工程，采用抗CIRBP‑N单克隆抗体36B4‑D8‑F4，和/或抗CIRBP‑C单克隆抗体11F11‑D9‑C6用于人CIRBP的ELISA试剂盒的制备，以及试剂盒在检测人CIRBP中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药
，具体为一种检测人CIRBP的ELISA试剂盒及其应用。
技术介绍
CIRBP(Cold-inducibleRNA-bindingprotein)被称为冷诱导蛋白，首先是作为当细胞受到冷刺激时，高度表达的一种蛋白而被发现的，同时也可以在低温下起到保护作用。随后被证明其含量的升高与机体的炎症有关。当机体受到刺激时，巨噬细胞会释放CIRBP，以DAMP方式诱导一些促炎因子(如IL-1β)的表达，严重时，进而引发大出血和脓毒症。CIRBP正常情况下存在于细胞核中，当细胞受到刺激时(如低氧、渗透压的改变、UV辐射)，CIRBP由细胞核转移到细胞质中，并集中在一个沉默mRNA集中的应急颗粒中。CIRBP可以结合到应急蛋白mRNA的3UTR区，稳定并促进这些蛋白的翻译，从而保护细胞免受应激所带来的伤害。近年来，CIRBP被认为是与肿瘤发生和发展相关的蛋白，编码CIRBP的基因又被称为是原癌基因，经报道，CIRBP在肿瘤细胞内以及肿瘤患者的血清中都有很高丰度的表达，一方面，CIRBP可以上调肿瘤细胞中的ERK、MEK、NF-κB的表达，并使之磷酸化，加速肿瘤细胞的恶化，促进癌症的发展；另一方面，CIRBP可以上调TERTmRNA的表达，同时结合并稳定TREC区域，共同增强端粒酶的活性，延长端粒以维持肿瘤细胞的活性。总之，CIRBP是与肿瘤增殖、侵袭、复发相关的一类蛋白，可以作为肿瘤进展的标志物。CIRBP是一个含172个氨基酸的蛋白，分子量为18KDa左右，有2个保守的结构域：N端的RRM(RNA识别区域)和C端的GGR(甘氨酸富集区域)。由于CIRBP比较保守，且在种属间具有较强的同源性。由于人和鼠的亲缘性较近，免疫鼠不容易得到亲和力高、特异性好的抗体，结构相差不大的蛋白甚至不容易产生免疫反应。相比之下，选择兔为免疫动物往往能解决上述问题，产生能针对某一抗原决定簇的高特异性、强亲和力的抗体。同时，兔的免疫系统产生的抗体多是位于小表位的，这在制备高灵敏度ELISA试剂盒时是需要的。目前，纵观各抗体生产商对于CIRBP抗体的研制，多数厂家生产的抗体免疫宿主来源是羊或兔，但基本上是以多克隆形式存在的。而对于的ELISA试剂盒的研发就更少。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测人CIRBP的ELISA试剂盒及其应用。本专利技术研发制备检测人CIRBP的ELISA试剂盒的思路如下：根据CIRBP空间结构上的特点，先是通过原核表达系统表达了其N端和C端的功能结构域片段，再将这2个功能片段分别免疫新西兰大白兔，得到了分别针对这2个片段的高效价单克隆抗体。再以针对不同抗原的单克隆抗体两两配对，组装成ELISA检测对。并对研发的ELISA试剂盒进行特异性、灵敏度、检测范围的验证。最后对临床上患有肝癌、结直肠癌、卵巢癌的患者血浆进行CIRBP含量的测定。本专利技术具体的技术方案如下：抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4，其编码轻链可变区的多肽序列如SEQIDNO:5所示，编码重链可变区的多肽序列如SEQIDNO:6所示。本专利技术还包括用于制备抗CIRBP的一对单克隆抗体对：包括抗CIRBP-N单克隆抗体，其编码轻链可变区的多肽序列如SEQIDNO:5所示，所述编码重链可变区的多肽序列如SEQIDNO:6所示；抗CIRBP-C单克隆抗体，其编码轻链可变区的多肽序列如SEQIDNO:7所示，所述编码重链可变区的多肽序列如SEQIDNO:8所示；上述单克隆抗体主要由以下方法制备：首先将CIRBP-N和CIRBP-C多肽片段作为抗原免疫兔子，通过多次不同途径的免疫，选取效价最高的兔子进行细胞融合；细胞融合时，取效价最高兔子的脾脏单细胞悬液，和对数生长期的兔骨髓瘤细胞240E-W3，在助融剂的作用下进行融合；将所述细胞融合后的细胞悬液进行单克隆培养，取长出克隆的上清做间接ELISA检测，所述单克隆培养采用的培养基为含有HAT的20％血清的RPMI1640；将效价高的孔中的克隆进行扩大培养，通过有限稀释法进行至少2次亚克隆，选取亚克隆的阳性率为90％以上的克隆为稳定克隆；将筛选出的细胞株进行扩大培养，培养上清经proteinA柱纯化，获得相应的抗体。本专利技术还包括抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4和/或抗CIRBP-C单克隆抗体11F11-D9-C6在制备检测人CIRBP的ELISA试剂盒中的应用。其中，抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4作为包被抗体；抗CIRBP-C单克隆抗体11F11-D9-C6作为检测抗体。一种检测人CIRBP的ELISA试剂盒，包括以下成分：1)预包被捕获抗体的酶条：包被终浓度为10μg/mL的抗CIRBP-N单克隆抗体，该单克隆抗体来自于权利要求1或2所述的单克隆抗体36B4-D8-F4；2)封闭液：2wt％海藻糖和0.4wt％明胶；3)稀释液：1wt％酪蛋白；4)检测抗体反应液：浓度为1mg/mL的生物素化抗CIRBP-C单克隆抗体；该单克隆抗体来自于权利要求2所述的单克隆抗体11F11-D9-C6；5)酶结合工作液：HRP偶联的链霉亲和素1mg/mL。优选的，所述ELISA试剂盒还包括：6)底物显色液：TMB底物反应液；7)终止液：2MH2SO4；8)标准品：10ng/mL的CIRBP溶液，100uL。本专利技术还包括上述ELISA试剂盒在检测人CIRBP的应用。其中，待检物反应时间为90min；检测抗体反应时间为60min。优选检测对象为人血液、血清，还包括人组织和细胞。本专利技术的ELISA试剂盒被证明对CIRBP有很好的检测效率的同时，也检测对于IFN-α、TNF-α、VEGF、MMP-9、IL-1β的反应。实验证明了检测CIRBP的值较高，而对于血浆中可能含有的其他蛋白的检测值都很低，证明本专利技术ELISA试剂盒有较好的特异性。同时本专利技术ELISA检测试剂盒是将抗CIRBP-N抗体作为捕获抗体，固定在96孔板上，用带有生物素标记的抗CIRBP-C抗体为检测抗体，这样极大程度降低了反应的假阳性，提高了检测的特异性以及灵敏度。通过一系列稀释梯度的CIRBP进行灵敏度的检测，得到本专利技术ELISA试剂盒检测限为1pg/mL，同时得到了检测范围是1-50g/mL。本专利技术利用研制的ELISA检测试剂盒对正常人和肿瘤患者的血清中CIRBP含量进行检测，发现肿瘤患者的血清中CIRBP含量较正常人明显升高，说明本专利技术ELISA试剂盒可以很有效地检测出人血清中CIRBP的含量。附图说明下面结合附图对本专利技术做进一步说明。图1：CIRBP-C-his和CIRBP-N-his克隆株表达产物鉴定图；其中1-a：抗His标签的抗体检测CIRBP-C-his的表达，1-b：抗His标签的抗体检测CIRBP-N-his的表达；图2：CIRBP-C-his偶联KLH的WB鉴定图，其中：Lane1：CIRBP-N-his；Lane2：KLH；Lane3：CIRBP-N-his偶联KLH；图3：KLH偶联的CIRBP-N-his抗原第三次免疫后血清效价测定；图4：SDS-PAGE单克隆抗体11F11-D9-C6表达产物的纯化，其中，Lane1：抗体的非还原状态；Lane2：抗体的本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗CIRBP‑N单克隆抗体36B4‑D8‑F4，其特征在于，所述抗CIRBP‑N单克隆抗体36B4‑D8‑F4的编码轻链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:5所示，编码重链可变区的多肽序列如SEQ ID NO:6所示。

【技术特征摘要】
1.抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4，其特征在于，所述抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4的编码轻链可变区的多肽序列如SEQIDNO:5所示，编码重链可变区的多肽序列如SEQIDNO:6所示。2.用于制备抗CIRBP的单克隆抗体对，其特征在于，包括抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4，所述抗CIRBP-N单克隆抗体36B4-D8-F4编码轻链可变区的多肽序列如SEQIDNO:5所示，编码重链可变区的多肽序列如SEQIDNO:6所示；抗CIRBP-C单克隆抗体1F11-D9-C6，所述抗CIRBP-C单克隆抗体1F11-D9-C6编码轻链可变区的多肽序列如SEQIDNO:7所示，编码重链可变区的多肽序列如SEQIDNO:8所示。3.权利要求1或2所述单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先将CIRBP-N和/或CIRBP-C多肽片段作为抗原免疫兔子，通过不同途径的免疫，选取效价最高的兔子进行细胞融合；细胞融合时，取效价最高兔子的脾脏单细胞悬液，和对数生长期的兔骨髓瘤细胞240E-W3，在助融剂的作用下进行融合；将所述细胞融合后的细胞悬液进行单克隆培养，取长出克隆的上清做间接ELISA检测，所述单克隆培养采用的培养基为含有HAT的20％血清的RPMI1640；将效价高的克隆进行扩大培养，通过有限稀释法进行至少2次亚克隆，选取亚克隆的阳性率为90％以上的克隆为稳定克隆，得到杂交瘤细胞株；将所得到的杂交瘤细胞株进行扩大培养，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斯文，赵磊，
申请(专利权)人：李斯文，赵磊，
类型：发明
国别省市：江苏;32