沙地柏调节植物氮营养和碱胁迫感应基因CML9（Q6‑1）及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种来自内蒙古西北部的强旱生植物沙地柏(Sabina vulgaris.)的可以调节植物氮营养和碱胁迫感应基因CML9(Q6‑1)。该基因编码蛋白具有钙离子结合位点。通过材料的准备、基因克隆以及后续植物表达载体的构建，进一步将该基因通过农杆菌介导的花絮侵染法，导入模式植物拟南芥野生型中，通过筛选抗性苗最终得到多株单基因插入、纯和T

【技术实现步骤摘要】
沙地柏调节植物氮营养和碱胁迫感应基因CML9(Q6-1)及其应用
本专利技术属于植物生物
，具体地说，涉及一种我国北方荒漠化地区防风固沙树种沙地柏(Sabinavulgaris.)有关氮营养及碱胁迫感应基因CML9(Q6-1)。本专利技术选用内蒙古蒙草抗旱股份有限公司苗木基地的树种沙地柏为实验材料，运用IlluminaSolexa转录组高通量测序的方法，获得该树种的氮营养及碱胁迫感应基因，对候选氮营养及碱胁迫感应的基因CML9(Q6-1)进行生物信息学分析，同时对其进行不同元素的表型分析，更直观的了解基因的生理学功能。
技术介绍
沙地柏(Sabinavulgaris.)，又名叉子圆柏、新疆圆柏，主要分布于内蒙古、陕西、新疆、宁夏、甘肃、青海等地。主要培育基地有江苏、浙江、安徽、湖南等地。沙地柏能忍受风蚀沙埋，长期适应干旱的沙漠环境，是干旱、半干旱地区防风固沙和水土保持的优良树种。喜光，喜凉爽干燥的气候，耐寒、耐旱、耐瘠薄，对土壤要求不严，不耐涝，在肥沃通透土壤成长较快。适应性强，扦插宜活，栽培管理简单，这种生命力坚强的常绿植物在北方绿化和造林中具有举足重轻的作用，所以研究沙地柏，对于野生植物抗旱相关基因的开发和利用具有重要意义。目前对于沙地柏的研究主要集中在生理和生态特性方面，在关于其抗旱基因的克隆及利用方面均无报道。我国植物分子育种能力同发达国家差距巨大，拥有自主知识产权的抗逆基因是世界植物分子育种领域竞争的焦点。对于植物抗逆基因的开发及利用，目前的研究主要集中于模式植物拟南芥或水稻、小麦等作物中，缺乏对野生植物体内丰富的抗逆基因的挖掘。本专利技术正是利用Illumina公司的高通量测序技术，对我国北方荒漠化地区防风固沙首选树种沙地柏进行转录组测序，获得了一种经自然环境长期筛选出氮营养及碱胁迫感应的基因CML9(Q6-1)。
技术实现思路
本专利技术的目的是的利用分子克隆技术，对有关氮营养及碱胁迫感应基因CML9(Q6-1)进行克隆，最终得到用于基因表达的表达载体，从而使该基因导入到拟南芥野生植物中并在野生植物体内表达，再通过表型分析进一步验证该基因的功能。本专利技术的实施方案是选用内蒙古蒙草抗旱有限公司苗木基地的沙地柏为实验材料，采用IlluminaSolexa转录组高通量测序的方法，对其转录组序列鉴定分析，确定Ca2+结合蛋白种类和数量，从而获得沙地柏有关氮营养及碱胁迫感应基因CML9(Q6-1)的核苷酸序列，通过分子克隆技术获得该基因，并将其导入到拟南芥中，最终获得转基因植株，通过对转基因植株进行表型分析了解基因的生物学功能。本专利技术的一个目的在于提供新的沙地柏抗旱相关基因，定名为CML9(Q6-1)，其序列为SEQNo.1的序列。本专利技术涉及一种在沙地柏根内表达量较高的基因，名称为CML9(Q6-1)，其核苷酸序列如序列表中SEQNO.1或SEQNO.2所示，其编码的67个氨基酸序列，如序列表中SEQNO.3所示。具体地说，本专利技术提供了含有下述序列之一的分离的多核苷酸：(1)序列表中的SEQNO.1或SEQNO.2；(2)与序列表中的SEQNO.1或SEQNO.2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；上述涉及的多核苷酸还包括取代、缺失和插入突变体以及等位变体、剪接变体、片段、衍生物等。本领域技术人员可以理解的是，上述的分离的多核苷酸也包括那些与SEQNO.1或SEQNO.2所示序列具有较高同源性的序列，例如同源性大于95％，或90％，甚至85％的序列；还包括那些在严谨条件下可与SEQNO.1或SEQNO.2所示序列杂交的序列；或者可与SEQNO.1或SEQNO.2的序列互补的序列。本专利技术同时提供了将本专利技术的新基因CML9(Q6-1)应用于植物抗旱基因工程的技术方案。本专利技术从沙地柏中成功地分离获得了一种经自然环境长期筛选出的抗相关基因CML9(Q6-1)，这给利用基因工程技术培育抗旱植物提供了新的方向，对干旱胁迫下的分子育种工作具有重要意义。具体来说，本专利技术的具体实施方案之一是将CML9(Q6-1)基因应用于植物基因工程以提高植物在干旱胁迫下的生存能力。以上概括的描述了本专利技术，可通过参照本文提供的某些具体实施例进一步理解本专利技术，这些实施例仅是为了说明而不是限制本专利技术。附图说明图1：实验总流程图。图2：CML9(Q6-1)五种T3代纯和植株分别在CK、0μMNO3-、pH7.0这三个浓度梯度生长条件下叶子的表型图(A)和鲜重图(B)，从图中可以更清晰的看到转基因植物的叶片在0μMNO3-上长势比野生型Col-0要好，而在pH7.0上转基因植株长势不如野生型植株。图3：CML9(Q6-1)五种T3代纯和植株分别在0μMCa2+、1μMABA、100mMNaCl这三个浓度梯度生长条件下叶子的表型图(A)和鲜重图(B)，从图中可以清晰的看到转基因植株的叶片与野生型植株没有差异。图4：表型分析中培养皿的种植方式。具体实施方式实施例1、沙地柏样品采集为了最大限度的增加其体内和抗逆性相关的RNA的丰富度，选择在天气相对寒冷的12月(2013年)进行沙地柏根的取样，样品在收集后迅速保存于液氮中备用。实施例2、表达载体的构建1、由于沙地柏植物的RNA较难提取，所以我们前期的目的基因是由南京金斯瑞公司合成的，后续表达载体的构建是用公司合成好的基因来完成的。合成基因所用的克隆载体是pUC57抗性是Amp。2、目的载体的连接和构建的完成本专利技术中用到的表达载体是pRI101AN，其抗性为Kan。目的载体的连接是将合成好的的基因片段和目的载体同时经过5’：SalI3′：EcoRI的酶切，经过DNA胶回收，DNA连接酶连接，然后转化大肠杆菌，经过菌落PCR和提取质粒，酶切验证的方法，最终获得连接到的载体基因的质粒。双酶切反应体系：a、目的片段与表达载体的连接：原则：按照目的片段和表达载体摩尔比是3∶1或1∶3的比例进行连接；T4DNA连接酶(1μl)+buffer(2μl)+17μl(目的片段+表达载体)；16℃过夜连接；b、转化：取大肠杆菌感受态于冰上解冻，将连有目的片段和表达载体的产物再次转化到大肠杆菌感受态里，混匀，冰浴30分钟，42℃热激90秒，立即置于冰上2分钟；加入500μl无抗性LB液体培养基，37℃摇床上200rpm或37℃恒温培养箱静置培养60分钟后，将菌液涂布与含有相应抗生素(Kan50mg/ml)的固体LB平板上；37℃倒置培养过夜后观察其结果。c、挑取菌板上的单菌落加入到含有Kan(50mg/ml)抗生素的5mlLB培养液里，37℃摇床过夜培养。d、质粒提取：选用TRAN的质粒提取试剂盒提取质粒。1)、取2ml过夜培养的菌液，10000xg离心1分钟，去上清。如菌液量大，可分多次离心收集。2)、加入250μl无色溶液RB(含RnaseA)，震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。3)、加入250μl蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解(不宜超过5分钟)。4)、加入350μl黄色溶液NB，轻轻混合5-6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2分钟。5)本文档来自技高网...

【技术保护点】
沙地柏(Sabina vulgaris.)调节植物氮营养和碱胁迫感应的基因CML9(Q6‑1)，其序列如SEQ No.1或SEQ No.2所示。

【技术特征摘要】
1.沙地柏(Sabinavulgaris.)调节植物氮营养和碱胁迫感应的基因CML9(Q6-1)，其序列如SEQNo.1或SEQNo.2所示。2.一种分离的多核苷酸，其序列为与权利要求1中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。3.由权利要求1或2中所述的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：张林，祁智，杨红艳，杨佳，刘亚玲，王召明，苑峰，金悦，
申请(专利权)人：内蒙古蒙草生态环境集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15