一种龙葵花青素合成调控基因SnATCN及其应用制造技术

本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域，提供了一种龙葵花青素合成调控基因SnATCN及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；发明专利技术人通过设计简并引物来扩增SnATCN基因的保守区域,然后再通过RACE‑PCR的方法从龙葵cDNA中扩增得到SnATCN基因的全长DNA序列；同时发现龙葵果实不同发育阶段花青素含量变化和SnATCN基因表达量变化成正相关关系，最后将SnATCN基因在烟草中进行瞬时表达，证实其能够激活烟草中花青素的合成，最终验证SnATCN基因对于花青素合成的正调控功能。

【技术实现步骤摘要】
一种龙葵花青素合成调控基因SnATCN及其应用
本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一种龙葵花青素合成调控基因SnATCN及其应用。
技术介绍
花青素作为一种广泛存在于植物中的水溶性色素，属于类黄酮类物质，存在于27个科的72个属的开花植物中(Sarmaetal.,1997)。作为一种天然色素,花青素是水溶性的并能赋予许多鲜花和水果紫色、蓝色和红色等颜色,并能促进传粉和种子分散(Shangetal.,2011)。许多研究证实,天然花青素能保护植物免受一些生物和非生物胁迫(Ballaréetal.,2003)。另外，富含花青素的饮食对于人类健康具有明显的保健功能。花青素具有治疗某些慢性疾病例如高血糖和抑制肿瘤细胞生长的作用，以及提高视力的作用。目前，影响植物花青素合成的基因主要分为结构基因和调控基因两大类。其中结构基因是直接编码花青素合成途径中的关键酶基因，主要包括CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UF3GT等。这些结构基因参与了花青素合成的不同阶段，其中CHS、CHI、F3H等属于早期结构基因，而DFR、ANS、UF3GT等属于晚期合成结构基因。而调控基因是编码转录因子的，它们能够参与调控以上结构基因的时空表达(Holtonetal.,2015)。转录因子主要是一些MBW(MYB-bHLH-WD40)复合物，其中MYB转录因子能够直接结合花青素合成上游相关结构基因(PAL、C4H、CHI等)的启动子区，调控其表达(Zhangetal.,2015)。bHLH则能够与MYB互作有利于其形成的复合物激活花青素下游一些结构基因(DFR、ANS、UF3GT等)的启动子并进行表达(Xuetal.,2015)。而WD40蛋白能够通过结合bHLH来维持MBW复合物的稳定性。例如，拟南芥中的AtPAP1/PAP2(MYB)、AtTTG1(WD40)以及AtTT8/GL3/EGL3(bHLH)共同调控花青素结构基因表达，从而影响拟南芥中花青素的合成(Hichrietal.,2011)。龙葵因具有多种生物活性被作为一种传统的中药植物广泛种植，其具有繁殖快速，结实率高的特点。其植株提取物具有消炎，抗菌，抑制肿瘤生长等作用。龙葵中虽然含有丰富的花青素(Huangetal.,2010)，但是目前还没有研究对龙葵中花青素的合成调控机制，及其相关基因的克隆和功能验证进行相关报道。因此，根据下述原因，对龙葵中花青素合成调控基因的克隆及功能验证具有重大应用价值：(1)Huang(2010)等在通过酸化处理龙葵果实0.5h后检测其中花青素含量达到了1.28mg/g，而Gavrilova(2011)等检测了作为花青素重要提取来源的蓝莓及黑加仑中的花青素含量，由于品种不同其含量仅为0.41-0.83mg/g以及0.14-1.8mg/g不等。这也暗示高花青素含量的龙葵果实可作为重要的花青素提取来源；(2)作为花青素重要的潜在提取来源，了解龙葵中花青素的合成调控机制，发掘新的花青素合成相关基因，为利用这些相关基因资源培育高花青素品种植株提供重要理论参考价值。分离克隆花青素合成调控基因是对龙葵中花青素合成机理研究的前提，但是由于龙葵基因组测序工作还未完成，其基因序列未知，使得从其中克隆分离基因会有一定难度，也因此很少有研究对于龙葵中花青素相关调控基因的克隆及功能分析进行研究报道。因此，寻找一种龙葵花青素合成调控基因，以及其简便可靠的基因克隆方法，以及功能验证方法对于从龙葵中克隆花青素合成调控基因及其功能验证是亟待解决的问题之一，该问题的解决将会为后来发掘这些花青素合成调控基因以及利用其作为基因操控对象培育高花青素含量株系提供重要应用价值。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人针对上述现有技术的情况，提供了一种龙葵花青素合成调控基因SnATCN及其应用，其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示,其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示；专利技术人通过设计简并引物来扩增SnATCN基因的保守区域,然后再通过RACE-PCR的方法从龙葵cDNA中扩增得到SnATCN基因的全长DNA序列；同时发现龙葵果实不同发育阶段花青素含量变化和SnATCN基因表达量变化成正相关关系，最后将SnATCN基因在烟草中进行瞬时表达，证实其能够激活烟草中花青素的合成，最终验证SnATCN基因对于龙葵花青素合成的正调控功能。上述的SnATCN基因是在龙葵基因组序列未知的情况下通过RACE-PCR的方法克隆获得，接着对于SnATCN基因的花青素正调控功能验证是通过将其在烟草中瞬时表达诱导花青素积累完成的。专利技术人专利技术人首先设计简并引物序列如SEQIDNo.6和SEQIDNo.7所示，从龙葵中克隆得到一个保守序列，将该保守序列进行测序如SEQIDNo.1所示；更进一步的，专利技术人从SnATCN基因保守序列设计了3’RACE以及5’RACEPCR的特异性引物，进行SnATCN基因的5’cDNA以及3’cDNA末端的扩增，将其序列进行测序如SEQIDNo.2及SEQIDNo.3所示；最后通过从5’cDNA以及3’cDNA末端序列设计SnATCN基因的全长DNA序列特异性扩增引物，得到了SnATCN基因的全长DNA序列，如SEQIDNo.4所示,其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示。在龙葵中获得了SnATCN基因后，又对龙葵果实不同发育阶段中花青素含量以及SnATCN基因的表达量之间的相关性进行了分析，发现随着果实成熟，花青素含量不断提高的同时SnATCN基因的表达量也不断提高，相关系数r＝0.93证实二者之前存在一个明显的正相关关系。更进一步的，本专利技术人将SnATCN基因克隆到瞬时表达载体pGR106中转化农杆菌(GV3101)，然后在烟草叶片中注射进行瞬时表达，发现SnATCN基因能够诱导烟草叶片中花青素的合成，同时随着烟草中花青素的积累，SnATCN基因的表达量也不断提高，相关系数r＝0.97也证实二者之间存在一个明显的正相关关系。综上所述，本专利技术的专利技术人在国际上首次提供了一个龙葵花青素合成调控基因SnATCN的DNA序列，以及SnATCN基因的分离克隆和功能验证方法。专利技术人首先利用RACE-PCR的方法从龙葵中克隆到SnATCN基因的全长DNA序列，然后对SnATCN基因的表达水平及其与龙葵果实不同发育阶段花青素含量之间的相关性进行了分析，发现二者正相关。最后专利技术人将SnATCN基因利用农杆菌介导的瞬时表达系统在烟草中进行注射，发现SnATCN基因能够诱导烟草中花青素的合成，从而验证了SnATCN基因对于龙葵中花青素合成的正调控作用。附图说明图1为本专利技术通过RACE-PCR的方法克隆龙葵中SnATCN基因的胶图；图中可见1-4号泳道分别是SnATCN基因的保守序列(113bp)、5’cDNA末端(564bp)、3’cDNA末端(844bp)以及全长DNA序列(792bp)；图2为龙葵果实不同发育阶段花青素含量与SnATCN基因表达量变化关系；图中可见随着果实中花青素含量升高(图2A,B)，SnATCN基因表达量也出现了类似的变化(图2C)，相关系数r＝0.93证实二者之前存在明显的正相关关系；图3为将SnATCN基因克隆到pGR106瞬时表达载体并在烟草中进行瞬时表达功能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种龙葵花青素合成调控基因SnATCN,其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种龙葵花青素合成调控基因SnATCN,其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；其编码的氨基酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁新华，汪少丽，储昭辉，贾茹，赵长宝，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37