本发明专利技术公开了一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明专利技术还提供了该启动子的制备方法，含有该启动子的载体和表达盒。本发明专利技术提供的启动子可以在时间和空间上调控目的基因的表达，从而用以深入研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控，可以在生产代谢产物的基因工程育种中的进行应用。因此，本发明专利技术对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用
本专利技术涉及植物生物
，具体涉及一种在植物非分泌型腺毛中特异表达的萜类合成酶基因启动子(proTPS7)及其在转基因植物中的应用。
技术介绍
青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿属一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性香气，从青蒿腺毛中提取的青蒿精油含有大量具有药理学或者生物灭杀活性的萜类化合物和黄酮类化合物。青蒿的叶片表面有两种腺毛：分泌型腺毛(glandularsecretorytrichome，GST)和非分泌型腺毛(Tshapetrichome，TST)，两种腺毛对于植物的生长、发育、防御和花粉传播等都起到至关重要的作用。青蒿素(Artemisinin)是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前抗疟药中效果最好、毒性最低的药物。青蒿素联合疗法(Artemisinin-basedcombinationtherapies，ACTs)已成为世界卫生组织推荐的治疗。目前青蒿素的主要来源是从青蒿的地上部分提取，然而，青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，这使得这种药物的大规模商业化生产受到了极大限制。启动子是位于结构基因5'端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启动子就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在目前青蒿的基因工程研究中，多采用组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，会过度消耗细胞内的物质和能量，并且不能在时间和空间上调控目的基因的表达，极可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。因此，本领域的技术人员致力于开发一种在植物的组织器官中特异性表达的启动子来代替组成型启动子，从而更好的对植物基因的表达进行调控。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种在植物的组织器官中特异性表达的启动子，从而在时间和空间上调控目的基因的表达，从而用以深入研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控。本专利技术的一方面提供了一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。该启动子为既是诱导型启动子，又是特异型启动子。该启动子为萜类合成酶基因启动子。进一步地，该启动子上的顺式作用元件包括：CGTCA-motif、HSE、MBS、MRE、TC-richrepeats、WUN-motif。本专利技术的另一方面提供了一种制备上述调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的方法，包括以下步骤：步骤一、从青蒿基因组中克隆该启动子的基因组序列；其中，青蒿基因组从培养的青蒿无菌苗中获得；步骤二、分析该启动子上的顺式作用元件，确定该启动子类型；步骤三、将步骤一中获得的该启动子的序列与载体连接；步骤四、将步骤三中获得的载体转化根癌农杆菌；步骤五、将步骤四中获得的带有上述载体的根癌农杆菌稳定转化植物；该植株为青蒿；步骤六、检测上述启动子的转入，并确定上述启动子所引导的基因在植株中的表达部位；检测启动子转入的方法为PCR检测，启动子引导的基因为GUS报告基因。进一步地，上述制备方法中，步骤一包括以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增所述启动子序列；其中，巢式PCR的引物为：进一步地，上述制备方法中，步骤三中的载体为pCAMBIA1391z，利用引物对1391z-proTPS7-F和1391z-proTPS7-R，通过PCR在获得的启动子序列中引入酶切位点PstI和NcoI，从而连接到载体pCAMBIA1391z上，其中引物序列如下所示：1391z-proTPS7-F：5’-AACTGCAGAAGAGAAAGCTACATACAATGGGAA-3’；1391z-proTPS7-R：5’-CATGCCATGGGGAGAAAGATCGGTTATGC-3’。进一步地，上述制备方法中，步骤五包括：1)外植体的预培养；2)农杆菌与外植体的共培养；3)抗性再生植株的筛选。本专利技术还提供了一种载体，该载体连接有上述调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子。本专利技术还提供了一种表达盒，该表达盒包括上述调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子。本专利技术还提供了上述调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子用于利用植物腺毛组织表达和在植物生产代谢产物的基因工程育种中的应用。本专利技术还提供了上述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子在非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控研究中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：由于腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子的种种弊端。因此，克隆到植物腺毛组织特异表达的启动子对于青蒿素代谢工程具有十分重要的意义。本专利技术利用有效的青蒿表皮腺毛组织特异性启动子代替组成型启动子，构建在分子生物学中在青蒿非分泌型腺毛特异表达目的基因的融合基因，利用遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中，从而实现目的基因的定向操作以获得转基因植物，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1是本专利技术的一个较佳实施例的转基因青蒿植株的PCR阳性检测。其中，M：分子量标记；1-2泳道：以转基因阴性青蒿植株的基因组DNA为模板的PCR产物；3-7：以转基因青蒿植株基因组DNA为模板的PCR产物；+：阳性对照；-：阴性对照。图2是本专利技术的一个较佳实施例的利用AaTPS7基因启动子与GUS基因融合的载体pCAMBIA1391z-proTPS7通过农杆菌介导稳定转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中GUS组织染色图。具体实施方式下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人的《分子克隆：实验室手册》(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989年版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008,28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105和质粒pCAMBIA1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。实施例1从青蒿基因组中克隆启动子的基因组序列1、培养青蒿无菌苗：青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(日光/黑夜)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；2、基因组DNA的提取在1.5mL离心管中放一片青蒿叶片(1cm2左右大小，用冰盒盛取)，加入2粒钢珠。加入300μLTPSbuffer(通风橱内操作，TPS中含有巯基乙醇)，55本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。2.一种制备如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、从青蒿基因组中克隆所述启动子的基因组序列；步骤二、分析所述启动子上的顺式作用元件，确定所述启动子类型；步骤三、将步骤一中获得的所述启动子的序列与载体连接；步骤四、将步骤三中获得的载体转化根癌农杆菌；步骤五、将步骤四中获得的带有所述载体的所述根癌农杆菌稳定转化植物；步骤六、检测所述启动子的转入，并确定所述启动子所引导的基因在植株中的表达部位。3.如权利要求2所述的制备如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的方法，其特征在于，所述步骤一包括以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增所述启动子序列。4.如权利要求2所述的制备如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的方法，其特征在于，所述步骤三中的载体为pCAMBIA1391z，利用引物对1391z-proTPS7-F和1391z-proTPS7-R，通过PCR在获得的所...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，陈俏，沈乾，付雪晴，石璞，孙小芬，颜廷祥，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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