使用核苷酸可逆终止子的离子传感器DNA和RNA合成测序制造技术

本发明专利技术涉及使用离子传感场效应晶体管和可逆核苷酸终止子在溶液中确定单链DNA或RNA的核苷酸残基的身份或对DNA或RNA进行测序的方法。

The ion sensors DNA and RNA were synthesized and sequenced using the nucleotide reversible Terminator

The present invention relates to the use of an ion sensing field effect transistor and a reversible nucleotide terminator to determine the identity of a nucleotide residue of a single stranded DNA or RNA in a solution, or to sequence a DNA or RNA.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用核苷酸可逆终止子的离子传感器DNA和RNA合成测序本申请要求于2014年5月19日提交的第62/000,306号美国临时申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。本申请通过引用并入名为“150518_0575_82337-PCT_SequenceListing_JAK.txt”的文件中记载的核苷酸和/或氨基酸序列，此文件大小为1千字节，于2015年5月18日以IBM-PC机格式创建，与MS-Windows的操作系统兼容，且作为本申请的一部分包含在于2015年5月18日提交的文本文件中。本专利技术受到政府的支持，在美国国立卫生研究院授予的基金号HG003582和HG005109下进行。美国政府对本专利技术有一定的权利。在本申请全文中，在括号中引用了某些出版物。在权利要求之前紧挨着权利要求可以找到这些出版物的完整引用。这些出版物的全部公开通过引用并入本申请以便更充分地描述本专利技术所涉及的现有技术。
技术介绍
从像生态学和进化这样不同的领域到基因发现和个性化医疗，高通量测序已成为基本所有现代生物学领域的基本支持技术。通过在其所有变体中使用大规模平行测序，可以鉴定整个生命树中基因之间的同源性，以检测个人的单核苷酸多态性(SNP)、变体拷贝数和基因组重排，详细表征转录组及其转录因子结合位点，并提供表观基因组的详细的甚至完整的视图(Hawkinsetal.2010；Morozovaetal.2009；Parketal.2009)。为了向前推进个性化医疗领域，必须为包括具有范围广泛的复杂疾病的个体在内的所有地缘种族群体的代表性样品收集完整的基因型和表型信息。拥有这样的数据概要最终将允许医生为每个患者定制疗法，同时将控制其对不同药物耐受和反应能力的遗传因素考虑在内。然而，这将要求全基因组测序的成本在大多数其他医学测试的成本范围内，通常认为其他医学测试的成本为1000美元或更少，并且要求每个碱基的错误率低于除了最罕见的SNP之外的所有SNP的频率(在10,000中<1)(Fulleretal.2009；Ngetal.2010；Shenetal.2010)。最近各种所谓的“下一代”测序技术已将相对高准确度的基因组测序成本降低至接近100,000美元，但即使在最富裕的国家对于医疗保健系统来说这个费用仍然很高。需要进一步提高当前技术的效率并引入突破性技术才能推动该领域实现1,000美元的目标。在“下一代”测序技术中，最流行的是合成测序(SBS)策略(Fulleretal.2009)，该策略以诸如Roche、Illumina、Helicos和IntelligentBiosystems等公司已商品化的或正在开发的多种仪器为基础。一种成功的SBS方法涉及荧光标记的核苷酸可逆终止子(NRT)的使用(Juetal.2003；Lietal.2003；Rupareletal.2005；Seoetal.2005；Juetal.2006)。这些核苷酸可逆终止子是修饰的dNTP(A、C、T/U和G)，所述修饰的dNTP具有碱基特异性荧光团和阻断糖的3'羟基从而阻止其通过将下一个核苷酸经由可化学裂解的键、可酶裂解的键或可光裂解的键连接到每个dNTP进行延伸。这允许中断聚合酶反应，根据连接的荧光标签的颜色确定并入的碱基，然后去除荧光团和3'-OH保护基团以允许再加入一个碱基。使用NRT的重要性在于，其大大降低了由加入多于一个核苷酸导致的预读的可能性，特别是在使用中间同步策略的情况下。Roche的焦磷酸测序方法(Ronaghietal.1998)以及Helicos的“虚拟”终止子的使用(Bowersetal.2009；Harrisetal.2008)均需要逐个添加每个碱基，随后得到间接读数(在前者中为光产生量)，或得到直接读数但该读数为单色(在后者中)。尽管这些方法具有不可否认的影响(Roche的方法具有长读长(readlength)，Helicos的方法具有单分子能力)，但是所述方法难以精确解码长于～4或5个碱基的同聚物片段(stretch)(Ronaghietal.2001)。此外，焦磷酸测序有假阳性问题，因为游离dNTP会在溶液中自发分解，释放焦磷酸(Gerstein2001)产生信号。最近，IonTorrent有限公司描述了测序策略，其中当每个核苷酸并入DNA链中时释放的质子被离子传感器捕获并使用半导体技术将其数字化(Andersonetal.2009；Rothbergetal.2011)。然而，由于这些策略使用天然核苷酸，因此无论并入四种核苷酸中的哪一种，这种输出都是相同的，这使逐一添加碱基的策略是必要的，且固有地难以在同聚物碱基运行时获得准确的读段(read)。已对SBS方法进行了描述，其中每个核苷酸具有独特的拉曼光谱峰，其中确定拉曼峰的波数用于鉴定并入的核苷酸类似物(PCT国际申请公开号WO2012/162429，其再次通过引用并入)。然而，使用拉曼光谱检测并鉴定核苷酸类似物具有这种技术固有的低灵敏度问题。
技术实现思路
本专利技术涉及在溶液中确定单链DNA的核苷酸残基的身份的方法，其包括：(a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)类似物在下述条件下接触：如果所述dNTP类似物与单链DNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与引物的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链DNA的核苷酸残基，则允许所述DNA聚合酶催化将所述dNTP类似物并入至所述引物中从而形成DNA延伸产物，其中(1)dNTP类似物具有以下结构：其中B为碱基并且为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，(2)R'为(i)-CH2N3或2-硝基苄基，或(ii)质量小于300道尔顿的烃基或取代烃基；以及(b)通过确定溶液的氢离子浓度是否增加来确定在步骤(a)中所述dNTP类似物是否并入了引物以形成DNA延伸产物，其中(i)如果所述dNTP类似物已并入引物，根据并入的dNTP类似物的身份确定单链DNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链DNA中的核苷酸残基的身份，以及(ii)如果氢离子浓度没有变化，重复进行步骤(a)，其中在步骤(a)的每次重复中，dNTP类似物包含的碱基的类型与步骤(a)的每次在前重复中dNTP类似物的碱基的类型不同，直到dNTP类似物并入引物以形成DNA延伸产物，并根据并入的dNTP类似物的身份确定单链DNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链DNA中核苷酸残基的身份。本专利技术还涉及在溶液中确定单链DNA的连续核苷酸残基的序列的方法，其包括：(a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)类似物在下述条件下接触：如果所述dNTP类似物与单链DNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与引物的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链DNA的核苷酸残基，则允许所述DNA聚合酶催化将所述dNTP类似物并入至所述引物中从而形成DNA延伸产物，其中(1)dNTP类似物具有以下结构：其中B为碱基并且为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，(2)R'为(i)-CH2N3或2-硝基苄基，或(ii)质量小于300道尔顿的烃基或取代烃基；以及(b)通过检测溶液的氢离子浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
在溶液中确定单链DNA的核苷酸残基的身份的方法，其包括：(a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)类似物在下述条件下接触：如果所述dNTP类似物与单链DNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与所述引物的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链DNA的核苷酸残基，则允许所述DNA聚合酶催化将所述dNTP类似物并入至所述引物中从而形成DNA延伸产物，其中(1)所述dNTP类似物具有以下结构：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.19 US 62/000,3061.在溶液中确定单链DNA的核苷酸残基的身份的方法，其包括：(a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)类似物在下述条件下接触：如果所述dNTP类似物与单链DNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与所述引物的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链DNA的核苷酸残基，则允许所述DNA聚合酶催化将所述dNTP类似物并入至所述引物中从而形成DNA延伸产物，其中(1)所述dNTP类似物具有以下结构：其中B为碱基并且为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，(2)R'为(i)-CH2N3或2-硝基苄基，或(ii)质量小于300道尔顿的烃基或取代烃基；以及(b)通过确定溶液的氢离子浓度是否增加来确定在步骤(a)中所述dNTP类似物是否并入了引物以形成DNA延伸产物，其中(i)如果所述dNTP类似物已并入引物，根据并入的dNTP类似物的身份确定所述单链DNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链DNA中的核苷酸残基的身份，以及(ii)如果氢离子浓度没有变化，重复进行步骤(a)，其中在步骤(a)的每次重复中，dNTP类似物包含的碱基的类型与步骤(a)的每次在前重复中dNTP类似物的碱基的类型不同，直到dNTP类似物并入引物以形成DNA延伸产物，并根据并入的dNTP类似物的身份确定单链DNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链DNA中核苷酸残基的身份。2.在溶液中确定单链DNA中连续核苷酸残基的序列的方法，其包括：(a)使具有与其一部分杂交的引物的单链DNA与DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)类似物在下述条件下接触：如果所述dNTP类似物与单链DNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与所述引物的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链DNA的核苷酸残基，则允许所述DNA聚合酶催化将所述dNTP类似物并入至所述引物中从而形成DNA延伸产物，其中(1)所述dNTP类似物具有以下结构：其中B为碱基并且为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶，(2)R'为(i)-CH2N3或2-硝基苄基，或(ii)质量小于300道尔顿的烃基或取代烃基；以及(b)通过检测溶液的氢离子浓度的增加来确定在步骤(a)中所述dNTP类似物是否并入，其中氢离子浓度的增加表明所述dNTP类似物已经并入引物以形成DNA延伸产物，如果溶液的氢离子浓度增加，则根据并入的dNTP类似物的身份确定所述单链DNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链DNA中的核苷酸残基的身份，并且其中氢离子浓度没有变化表明在步骤(a)中所述dNTP类似物没有并入引物中；(c)如果在步骤(b)中未检测到氢离子浓度的变化，重复进行步骤(a)和(b)，其中在针对正被测定身份的指定核苷酸残基的步骤(a)的每次重复中，dNTP类似物包含的碱基的类型与针对所述核苷酸残基的步骤(a)的每次在前重复中dNTP类似物的碱基的类型不同，直到dNTP类似物并入引物以形成DNA延伸产物，并根据并入的dNTP类似物的身份确定所述单链DNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链DNA中核苷酸残基的身份；(d)如果已检测到氢离子浓度的增加并且并入了dNTP类似物，则随后处理并入的dNTP核苷酸类似物以便用H原子代替其R'基团，从而在DNA延伸产物的3'端提供3'OH基团；以及(e)根据需要，对待测序的单链DNA的连续核苷酸残基的每个核苷酸残基重复进行步骤(a)至(d)，除了：在步骤(a)的每个重复中，(i)dNTP类似物并入由步骤(a)或步骤(c)的在前重复产生的DNA延伸产物中，并且(ii)dNTP类似物与单链DNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与由步骤(a)或步骤(c)的在前重复产生的DNA延伸产物中的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链DNA的核苷酸残基，从而形成随后的DNA延伸产物；条件是对于待测序的最后一个核苷酸残基，步骤(d)是任选的，由此确定所述单链DNA的连续核苷酸残基中每一个核苷酸残基的身份，从而确定所述DNA的连续核苷酸残基的序列。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中R'为-CH2N3；其中R'为取代烃基且为硝基苄基；其中R'为2-硝基苄基；或者其中R'为烃基且为烯丙基(-CH2-CH＝CH2)。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中在每个dNTP类似物中，R'具有以下结构：其中Rx独立地为质量小于300道尔顿的取代或未取代的C1-C5烷基、C2-C5烯基或C2-C5炔基，或为H，其中波浪线表示与3'氧原子的连接点；或其中R'具有以下结构：其中波浪线表示与3'氧原子的连接点。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述DNA在设置在传感器上的反应室内的溶液中，所述传感器(i)形成在半导体衬底中，并且(ii)包括场效应晶体管或化学场效应晶体管，所述场效应晶体管或化学场效应晶体管被配置为用于响应由核苷三磷酸或核苷三磷酸类似物与引物或DNA延伸产物之间磷酸二酯键的形成引起的溶液氢离子浓度增加而提供至少一个输出信号。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述反应室是设置在传感器阵列上的多个反应室之一，所述传感器阵列形成于半导体衬底中且包括多个传感器，每个反应室设置在至少一个传感器上，且阵列中的每个传感器包括场效应晶体管或化学场效应晶体管，所述场效应晶体管或化学场效应晶体管被配置为用于响应由核苷三磷酸或核苷三磷酸类似物与引物或DNA延伸产物之间磷酸二酯键的形成引起的溶液氢离子浓度增加而提供至少一个输出信号。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述阵列的每个所述传感器占据100μm或更小的面积并具有10μm或更小的间距，并且其中每个所述反应室具有1μm3至1500μm3范围内的容积；或其中每个所述反应室容纳溶液中的至少105个单链DNA拷贝。8.根据权利要求6和7中任一项所述的方法，其中所述多个反应室和所述多个传感器各自的数目均大于256,000。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述溶液中的单链DNA被连接至固体基质；其中所述溶液中的引物被连接至固体基质；其中所述单链DNA或引物通过1,3-偶极叠氮化物-炔烃环加成化学反应连接至固体基质；其中所述单链DNA或引物通过聚乙二醇分子连接至固体基质；其中所述单链DNA或引物通过聚乙二醇分子连接至固体基质且是叠氮基官能化的；其中所述DNA或引物通过叠氮基连接、炔基连接或生物素-链霉亲和素相互作用连接至固体基质；其中所述DNA或引物是炔标记的；其中所述DNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质为以下形式：芯片、珠、孔、毛细管、载玻片、晶片、过滤器、纤维、多孔介质、基质、多孔纳米管或柱；其中所述DNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质为金属、金、银、石英、二氧化硅、塑料、聚丙烯、玻璃、尼龙或金刚石；其中所述DNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质是附着有或浸渍有金属或金属组合的多孔非金属物质；其中所述DNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质又被连接至第二固体基质；或其中所述DNA或引物被连接至固体基质，所述固体基质又被连接至第二固体基质，所述第二固体基质为芯片。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中1×109个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×108个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中2×107个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×107个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×106个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×104个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；或其中1,000个或更少的DNA或引物拷贝被连接至固体基质。11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中10,000个或更多的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×107个或更多的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；其中1×108个或更多的DNA或引物拷贝被连接至固体基质；或其中1×109个或更多的DNA或引物拷贝被连接至固体基质。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述DNA或引物隔开在独立的隔室、孔或固体表面上的凹陷中。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其在多个单链DNA上平行进行，并且其中任选地所述单链DNA是具有相同序列的模板。14.根据权利要求13所述的方法，其还包括在步骤(b)或(c)中已确定核苷酸残基的残基后，视情况使所述多个单链DNA或模板与双脱氧核苷三磷酸接触，从而永久地封闭任何未延伸的引物或未延伸的DNA延伸产物，所述双脱氧核苷三磷酸与已被鉴定的核苷酸残基互补。15.根据权利要求13或14中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前从DNA样品扩增单链DNA；并且其中任选地通过聚合酶链式反应扩增单链DNA。16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中紫外光用于处理并入引物或DNA延伸产物的dNTP类似物的R'基团，以便光化学裂解连接到3'-O的部分从而用3'-OH代替3'-O-R'；其中所述部分任选为2-硝基苄基部分。17.在溶液中确定单链RNA的核苷酸残基的身份的方法，其包括：(a)使具有与其一部分杂交的RNA引物的单链RNA与聚合酶和核糖核苷三磷酸(rNTP)类似物在下述条件下接触：如果所述rNTP类似物与单链RNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与RNA引物的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链RNA的核苷酸残基，则允许所述聚合酶催化将所述rNTP类似物并入至所述RNA引物中从而形成RNA延伸产物，其中(1)rNTP类似物具有以下结构：其中B为碱基并且为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，(2)R'为(i)-CH2N3或2-硝基苄基，或(ii)质量小于300道尔顿的烃基或取代烃基；以及(b)通过确定溶液的氢离子浓度是否增加来确定在步骤(a)中所述rNTP类似物是否并入了RNA引物以形成RNA延伸产物，其中(i)如果所述rNTP类似物已并入RNA引物，根据并入的rNTP类似物的身份确定所述单链RNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链RNA中的核苷酸残基的身份，以及(ii)如果氢离子浓度没有变化，则重复进行步骤(a)，其中在步骤(a)的每次重复中，rNTP类似物包含的碱基的类型与步骤(a)的每次在前重复中rNTP类似物的碱基的类型不同，直到rNTP类似物并入所述RNA引物以形成RNA延伸产物，并根据并入的rNTP类似物的身份确定所述单链RNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链RNA中核苷酸残基的身份。18.在溶液中确定单链RNA中连续核苷酸残基的序列的方法，其包括：(a)使具有与其一部分杂交的RNA引物的单链RNA与RNA聚合酶和核糖核苷三磷酸(rNTP)类似物在下述条件下接触：如果所述rNTP类似物与所述单链RNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与所述RNA引物的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链RNA的核苷酸残基，则允许所述RAN聚合酶催化将所述rNTP类似物并入至所述RNA引物中从而形成RNA延伸产物，其中(1)所述rNTP类似物具有以下结构：其中B为碱基并且为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，(2)R'为(i)-CH2N3或2-硝基苄基，或(ii)质量小于300道尔顿的烃基或取代烃基；以及(b)通过检测溶液的氢离子浓度的增加来确定在步骤(a)中所述rNTP类似物是否并入，其中氢离子浓度的增加表明所述rNTP类似物已经并入RNA引物以形成RNA延伸产物，如果溶液的氢离子浓度增加，则根据并入的rNTP类似物的身份确定所述单链RNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链RNA中的核苷酸残基的身份，并且其中氢离子浓度没有变化表明在步骤(a)中rNTP类似物没有并入RNA引物中；(c)如果在步骤(b)中未检测到氢离子浓度的变化，重复进行步骤(a)和(b)，其中在针对正被测定身份的指定核苷酸残基的步骤(a)的每次重复中，rNTP类似物包含的碱基的类型与针对所述核苷酸残基的步骤(a)的每次在前重复中rNTP类似物的碱基的类型不同，直到rNTP类似物并入所述RNA引物以形成RNA延伸产物，并根据并入的rNTP类似物的身份确定所述单链RNA中与其互补的核苷酸残基的身份，由此确定所述单链RNA中核苷酸残基的身份；(d)如果已检测到氢离子浓度的增加并且并入了rNTP类似物，则随后处理并入的rNTP核苷酸类似物以便用H原子代替其R'基团，从而在RNA延伸产物的3'端提供3'OH基团；以及(e)根据需要，对待测序的单链RNA的连续核苷酸残基的每个核苷酸残基重复进行步骤(a)至(d)，除了：在步骤(a)的每次重复中，(i)rNTP类似物并入由步骤(a)或步骤(c)的在前重复产生的RNA延伸产物中，并且(ii)rNTP类似物与单链RNA的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基在5'方向上紧挨着与由步骤(a)或步骤(c)的在前重复产生的RNA延伸产物中的3'末端核苷酸残基杂交的所述单链RNA的核苷酸残基，从而形成随后的RNA延伸产物；条件为对于待测序的最后一个核苷酸残基，步骤(d)是任选的，由此确定所述单链RNA的连续核苷酸残基中每个核苷酸残基的身份，从而确定所述RNA的连续核苷酸残基的序列。19.根据权利要求17或18所述的方法，其中R'为-CH2N3；其中R'为取代烃基且为硝基苄基；其中R'为2-硝基苄基；或者其中R'为烃基且为烯丙基(-CH2-CH＝CH2)。20.根据权利要求17或18所述的方法，其中在每个rNTP类似物中，R'具有以下结构：其中Rx独立地为质量小于300道尔顿的取代或未取代的C1-C5烷基、C2-C5...

【专利技术属性】
技术研发人员：静岳·具，詹姆士·J·鲁索，于林，
申请(专利权)人：哥伦比亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US