提高测序准确性的方法技术

本发明专利技术提供了提高测序准确性的方法。例如，本发明专利技术的方法使用线性扩增来产生模板分子的相对较小的群体，其随后可以扩增成DNA分子的较大的克隆群体以用于测序。

Methods to improve sequencing accuracy

The present invention provides methods for improving the accuracy of sequencing. For example, the method of the present invention uses linear amplification to produce relatively small groups of template molecules, which can then be amplified into larger clones of DNA molecules for sequencing.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高测序准确性的方法本专利技术提供了提高测序准确性的方法。例如，本专利技术的方法使用线性扩增从模板分子产生通常相对小的互补链群体，其中从特定模板产生的互补链彼此紧密接近保持，从而在分子与分子水平上校正错误。可以随后将线性扩增的群体扩增成较大的DNA分子的克隆群体，例如通过指数扩增以进行测序。在克隆扩增方案中的第一次延伸期间，可能将错误引入DNA。图1示出了第一延伸期间的误掺入(misincorporation)错误的示意图100。在该实例中，首先将DNA分子与表面结合的寡核苷酸杂交。杂交的寡核苷酸然后在称为“第一延伸”的步骤中通过DNA聚合酶延伸。在该实例中，聚合酶在第一延伸步骤期间在特定位置处掺入不正确的核苷酸(误掺入的碱基显示为交叉/星)。在第一次延伸后，进行扩增步骤，其产生在第一次延伸期间生成的DNA分子的多个拷贝。在扩增期间，在第一延伸步骤期间引入的错误在作为克隆群体的部分的所有分子中传播(propagate)。误掺入的碱基将被测序为“高质量错误”，其可能难以与样品中的真实突变区分开。在克隆扩增过程的第一或第二循环中产生的掺入错误在该特定位置被测序时产生混合信号。图2示出了在第一扩增循环期间的误掺入错误的示意图200(误掺入的碱基显示为交叉/星)。在此早期阶段时，克隆群体由两种分子组成；一种分子具有正确的碱基，而另一种分子携带误掺入的碱基。随着克隆扩增过程继续，这两个分子用作模板以产生更多的DNA分子。最终的克隆群体可以由大约相等量的野生型和误掺入的分子两者组成，尽管随机事件可能使比率偏斜。由分子的混合群体产生的混合信号产生“低质量”碱基识别(basecall)。误掺入事件发生的时机(timing)(循环数)，连同在扩增的早期循环中发生的随机效应，将影响存在于特定克隆群体中的野生型和突变体分子的比例。在一个实施方案中，本专利技术的方法可用于实质性减少或消除在第一延伸期间可能产生的高质量错误。在另一个实施方案中，本专利技术的方法还可以用于减少由在扩增的前几个循环期间核苷酸的误掺入引起的错误。根据本专利技术，提供了具有改善的准确性的测序方法，所述方法包括：提供核酸模板；通过线性扩增直接从所述模板核酸产生包含彼此紧密接近保持(retainedincloseproximitytoeachother)或可鉴定为从相同模板核酸获得的多个互补寡核苷酸链的群体；并且对所述接近保持(saidproximityretained)(例如表面结合)的寡核苷酸实施测序反应。优选地，存在有至少三轮的线性扩增。通过具有最小数量的三轮线性扩增，与典型的指数扩增方法相比，任何引入的错误的影响将被稀释。例如，如果我们假设从表面上的ssDNA链A开始，那么线性扩增仅在每轮中产生拷贝A’，而指数扩增在第一轮中产生A’，但然后在随后的轮次中A和A’两者，那么在第一轮产生A’中产生的错误将导致A’链在第1轮的100％错误(对于两种扩增)，在第2轮的50％错误(对于两种扩增)，但是然后在第3轮时，只有1/3的A’链在线性扩增中具有错误，但对于指数扩增，2/4的A’链具有错误。在这之后，使用指数扩增继续产生具有错误的A’链的50％，而使用本方法，使用核酸模板的线性扩增，错误变得更稀释。下面的实例显示了用于线性扩增和指数扩增的错误传播的比较，其中A和A’表示制备的链，并且粗体和下划线表示含有突变的链。优选地，该方法还包括在线性扩增轮次之后且实施测序反应之前实施互补链群体的进一步(指数)扩增的步骤。任选地，包含通过线性扩增直接从模板核酸获得的多个互补链的群体在它们结合到表面时保持彼此紧密接近。或者，包含通过线性扩增直接从模板核酸获得的多个互补链的群体由于它们保持在防止或限制扩散的凝胶或乳液中而保持彼此紧密接近。优选地，提供多个核酸模板，并且产生多个互补链群体，其中每个群体直接自模板衍生，并且从每个模板衍生的群体衍生的成员保持彼此紧密接近。有利地，通过在克隆扩增之前通过特定表面结合文库分子的线性扩增创建分子，由所述线性扩增创建的分子保持紧密接近。以这种方式的表面结合非常容易地导致进一步的测序步骤。自相同模板衍生的线性扩增分子群体的紧密接近保持也可以通过在线性扩增后杂交或附着扩增分子来实现，例如如果使用滚环扩增的话。紧密接近的保持还可以通过在凝胶或乳液内进行线性扩增循环以防止自由扩散来实现。这允许利用稀释效应，使得任何误掺入错误将被稀释掉(因为通过线性扩增创建的互补链群体中的两个分子将携带相同突变是极不可能的)。虽然完全在溶液中的线性扩增步骤(即，对于直接从相同核酸模板获得的群体，没有互补链的紧密接近保持)将降低总体错误率，但其仍然导致“高质量错误”得到维持(beingcarriedthrough)，因为此类情况下的误掺入步骤(无论在溶液线性扩增步骤中还是在指数扩增步骤中)将导致携带突变的簇(cluster)。本方法允许区分由于延伸误差所致的假象(artefacts)，因为它们(在表面结合或以其它方式接近保持或扩散受限)线性扩增期间被凝胶稀释掉，而真实突变在样品自身中。任选地，该方法包括将核酸模板附着到表面的步骤。这可以通过将所述核酸模板与位于表面上的第一引物杂交。或者，可以将模板核酸直接附着到表面。优选地，互补链群体的进一步扩增利用附着于表面的另外的扩增引物，所述另外的扩增引物不参与线性扩增步骤。任选地，(直接从核酸模板)线性扩增包括以下步骤：将所述核酸模板与第一引物杂交；延伸所述第一引物以产生所述模板的互补链；变性以释放保持紧密接近的互补链(例如它保持结合于表面，因此完全不移动或在附近再杂交之前不扩散得较远)；并且重复杂交和扩增步骤以产生直接从模板核酸获得的表面结合互补链的群体。任选地，线性扩增可以使用重组酶聚合酶扩增(RPA)。任选地，线性扩增可以使用“WildfireTM”(LifeTechnologies)类型扩增，通过模板步行过程(templatewalkingprocess)制备模板链的线性拷贝。优选地，克隆扩增步骤是桥式扩增。优选地，该方法包括测序步骤。任选地，第一引物结合到固体支持物。优选地，固体支持物是平面元件。优选地，固体支持物是流动池。任选地，固体支持物是珠。或者，在附着于固体支持物的表面之前环化单链模板核酸，例如通过杂交进行。环化可以使用环连接酶(circligase)。滚环扩增(RCA)导致直接从模板核酸获得的互补链的多联体。优选地，然后将多联体结合到固体支持物。优选地，固体支持物包含多个第二引物或其片段。第二引物的片段不具有足够的大小以允许在线性扩增步骤中使用的条件下直接延伸。优选地，所述方法包括将反向互补寡核苷酸与第二引物片段杂交的步骤，其中所述反向互补寡核苷酸在其5’端包含作为全长第二引物序列的一部分的额外碱基。复制杂交的引物以延长表面引物，从而使它们适于进一步用于例如指数扩增。任选地，将第二引物或其片段接枝(graft)到附着点上。可以通过链霉抗生物素蛋白/生物素连接或通过链霉抗生物素蛋白/双重生物素连接接枝。任选地，固体支持物上的仅约一半的接枝位点被第一引物占据。或者，可以存在偏斜比率(skewedratio)。任选地，可以通过寡核苷酸浓度，温育时间和/或温度来控制接枝过程。优选地，随后将第二引物接枝到剩余的可用接本文档来自技高网...

【技术保护点】
改善测序时的准确性的扩增方法，所述方法包括：提供核酸模板；通过线性扩增直接从所述模板核酸产生包含彼此紧密接近保持或可鉴定为从相同模板核酸获得的多个互补寡核苷酸链的群体；并且对所述接近保持或可鉴定为从所述相同模板核酸获得的寡核苷酸实施测序反应。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.14 GB 1410646.21.改善测序时的准确性的扩增方法，所述方法包括：提供核酸模板；通过线性扩增直接从所述模板核酸产生包含彼此紧密接近保持或可鉴定为从相同模板核酸获得的多个互补寡核苷酸链的群体；并且对所述接近保持或可鉴定为从所述相同模板核酸获得的寡核苷酸实施测序反应。2.如权利要求1中的方法，其中存在有至少三轮线性扩增。3.如权利要求1或2中的方法，其中所述方法还包括在所述线性扩增轮次后实施所述互补链群体的进一步指数扩增的步骤。4.如前述权利要求中任一项中的方法，其中通过线性扩增直接从所述模板核酸获得的所述多个互补链(即，所述链群体)在它们与表面结合时保持彼此紧密接近。5.如权利要求1至3中任一项中的方法，其中通过线性扩增直接从所述模板核酸获得的所述多个互补链(即，所述链群体)在它们保持在防止或限制扩散的凝胶或乳液中时保持彼此紧密接近。6.如前述权利要求中任一项中的方法，其中提供多个核酸模板，并且产生多个互补链群体，其中每个群体直接从模板衍生，并且从每个模板衍生的群体的成员保持彼此紧密接近。7.如前述权利要求中任一项中所述的方法，其中所述线性扩增包括以下步骤：将所述核酸模板与第一引物杂交；延伸所述第一引物以产生所述模板的互补链；变性以释放保持紧密接近的互补链；并且重复杂交和扩增步骤以产生直接从所述模板核酸获得的互补链群体。8.如权利要求3至7中的方法，其中所述互补链群体的进一步指数扩增是桥式扩增。9.如权利要求7或8任一项中的方法，其中将所述第一引物结合到所述表面。10.如前述权利要求任一项中的方法，其中所述表面是固体支持物。11.如前述权利要求任一项中的方法，其中所述表面是平面元件(planarelement)。12.如权利要求10或11任一项中的方法，其中所述固体支持物是流动池或珠。13.如前述权利要求任一项中的方法，其中在线性扩增之前环化所述核酸模板。14.如权利要求13中的方法，其中环化使用环连接酶(circligase)。15.如权利要求13或...

【专利技术属性】
技术研发人员：R里加蒂，JM鲍特尔，
申请(专利权)人：伊卢米纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB