用于生产带标签的核苷酸的化学方法技术

本公开提供用于将纳米孔可检测的标签连接至核苷酸的系统和方法。本公开还提供使用所公开的带标签的核苷酸对核酸进行测序的方法。本文提供连接有标签的核苷酸以及用于将标签连接至核苷酸的方法。可通过化学反应例如“dick化学”连接标签。在一个方面，本公开提供带标签的核苷酸，其包含(a)具有末端磷酸酯的多磷酸酯部分；和(b)通过三唑、1,2‑二嗪、二硫化物、仲胺、腙、硫代乙酰胺或马来酰亚胺‑硫加成物共价结合至核苷酸的末端磷酸酯的标签。

Chemical process for producing nucleotides with labels

The present disclosure provides systems and methods for connecting nano detectable labels to nucleotides. The present disclosure also provides methods for sequencing nucleic acids using the disclosed tagged nucleotides. The present invention provides a tagged nucleotide and a method for connecting a label to a nucleotide. A chemical reaction, such as \Dick chemistry\, may be used to connect labels. In one aspect, the invention provides a nucleotide labeled, comprising polyphosphate (a) part with terminal phosphate; and (b) plus end compounds covalently bound to nucleotide phosphate tags through three 1,2 azole, two triazine, two sulfide, secondary amine, hydrazone, thioacetamide or maleimide sulfur.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产带标签的核苷酸的化学方法本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2014年3月24日提交的美国临时专利申请第61/969,628号的优先权，其内容通过引用的方式并入本文。本专利技术在由美国国立卫生研究院给予的第5R01HG007415号基金下、在政府的支持下进行。政府拥有本专利技术的一些权利。本申请通过引用并入存在于名为“150323_0575_85625_序列表_JAK.txt”的文件中的核苷酸和/或氨基酸序列，该文件大小为52千字节，于2015年3月23日以IBM-PC机器格式生成、具有与MS-Windows的操作系统的兼容性、包含在于2015年3月23日提交的文本文件中作为本申请的一部分。
本申请涉及带标签的核苷酸组合物、制备和使用所公开的带标签的核苷酸组合物用于对核酸测序的方法，特别是基于纳米孔的测序方法。通过引用的方式并入在本申请说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用的方式并入本文，其并入程度如同明确且单独地指定通过引用的方式并入每个单独的出版物、专利或专利申请。
技术介绍
核酸测序是测定核酸核苷酸序列的方法。这样的序列信息可有助于诊断和/或治疗个体。例如，个体的核酸序列可以用于鉴定、诊断和潜在地开发用于遗传疾病的疗法。作为另一个实例，对病原体的研究可以得到用于传染性疾病的疗法。由于一些疾病的特征在于在于具有数百万个核苷酸的链中少至一个核苷酸差异，所以高度准确的测序是必要的。存在可用于对核酸进行测序的方法。然而，这样的方法是昂贵的，并且可能不能在一段时间内以诊断和/或治疗个体所必需的精度提供序列信息。在一些情况下，使单链核酸分子通过纳米孔的核酸测序方法的灵敏度不足。核苷酸碱基(例如腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和/或尿嘧啶(U))可能不能提供彼此之间差别足够大的信号。特别是，嘌呤(即A和G)具有彼此相似的大小、形状和电荷，在一些情况下提供的信号差别不够大。同样，嘧啶(即C，T和U)具有彼此相似的大小、形状和电荷，在一些情况下提供的信号差别不够大。Kumar等人(2012)描述了使用纳米孔来区分通过末端5’-磷酰胺酯(phosphoramidate)与dG核苷酸连接的四种不同长度的PEG-香豆素标签，并且分别证明了通过DNA聚合酶有效且精确地并入这四种PEG-香豆素带标签的dG核苷酸。还参见美国专利申请公开US2013/0244340A1和US2013/0264207A1。在本文中认识到了需要用于核苷酸鉴定和核酸测序的经改进的组合物和方法。
技术实现思路
本文提供连接有标签的核苷酸和将标签连接至核苷酸的方法。可以通过化学反应连接标签，例如“Click化学反应(clickchemistry)”。在一个方面，本专利技术提供带标签的核苷酸，其包含：(a)具有末端磷酸酯的多磷酸酯部分；和通过三唑、1,2-二嗪、二硫化物、仲胺、腙、硫代乙酰胺或马来酰亚胺-硫加成物共价结合至所述核苷酸的、末端磷酸酯的标签。在带标签的核苷酸的一些实施方案中，标签通过三唑共价结合至所述末端磷酸酯。在一些实施方案中，所述三唑具有如下结构：其中R1包含标签，R2包含核苷酸；或者其中R1包含核苷酸，R2包含标签。在一些实施方案中，所述三唑具有如下结构：其中R1和R3联合形成环状部分；并且其中联合的R1和R3包含标签，R2包含核苷酸；或者其中联合的R1和R3包含核苷酸，R2包含标签。在一些实施方案中，所述三唑通过叠氮与炔之间的反应形成。在带标签的核苷酸的一些实施方案中，标签通过1,2-二嗪共价结合至所述末端磷酸酯。在一些实施方案中，1,2-二嗪包含二氢哒嗪部分。在一些实施方案中，1,2-二嗪或二氢哒嗪部分通过四嗪和反式环辛烯之间的反应形成。在带标签的核苷酸的一些实施方案中，多磷酸酯部分在核苷酸的5’位置处。在一些实施方案中，多磷酸酯部分包含至少3个磷酸酯、至少4个磷酸酯、至少5个磷酸酯、至少6个磷酸酯或至少7个磷酸酯。在一些实施方案中，多磷酸酯部分包含4-6个磷酸酯。在一些实施方案中，多磷酸酯部分包含6个磷酸酯。在一些实施方案中，标签和末端磷酸酯之间的共价结合可以包含接头或间隔子(spacer)部分。在一些实施方案中，接头或间隔子部分包含具有至少2个碳至约12个碳的烷基。在带标签的核苷酸的一些实施方案中，标签包括核苷酸、寡核苷酸、肽、聚乙二醇(PEG)、寡糖、碳水化合物、肽核酸(PNA)、乙烯基聚合物、其他水溶性聚合物或其任意组合。在带标签的核苷酸的一些实施方案中，标签包含寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸标签包含至少7个单体单元、至少10个单体单元、至少15个单体单元、至少20个单体单元、至少25个单体单元、至少30个单体单元、至少35个单体单元、至少40个单体单元或者至少50个或更多个单体单元。在带标签的核苷酸的一些实施方案中，标签包含寡核苷酸，其中寡核苷酸包含非天然核苷酸。在一些实施方案中，非天然核苷酸包含选自L-核苷酸、2’,5’-连接(linkage)、α-D-核苷酸、非天然存在的核苷酸间连接、非天然存在的碱基、非天然存在的糖部分以及其任意组合的组。在一些实施方案中，非天然核苷酸包含选自硝基吡咯、硝基吲哚、nabularine、泽布拉林、苯和苯衍生物的非天然存在的碱基。在一些实施方案中，非天然核苷酸包含选自磷酸三酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、硼磷酸酯、磷酸酰胺酯和吗啉基部分的非天然存在的核苷酸间连接。在带标签的核苷酸的一些实施方案中，标签包含寡核苷酸，其中寡核苷酸的5’-端共价结合至多磷酸酯部分的末端磷酸酯。在一些实施方案中，5’端共价结合至末端磷酸酯的寡核苷酸进一步包含其3’末端的化学修饰，所述其3’末端的化学修饰保护其免受核酸外切酶降解。在一些实施方案中，所述其3’末端的化学修饰选自磷酸酯化和与C3-烷基至C12-烷基间隔子的共价结合。在带标签的核苷酸的其他实施方案中，标签包含寡核苷酸，其中寡核苷酸的3’-端共价结合至多磷酸酯部分的末端磷酸酯。在一些实施方案中，3’端共价结合至末端磷酸酯的寡核苷酸进一步包含其5’末端的化学修饰，所述其5’末端的化学修饰保护其免受核酸外切酶降解。在一些实施方案中，所述其5’末端的化学修饰选自磷酸酯化和与C3-烷基至C12-烷基间隔子的共价结合。在带标签的核苷酸的一些实施方案中标签包含寡核苷酸，其中寡核苷酸包含接头，所述接头包含花青染料部分。在一些实施方案中，花青染料部分为Cy3部分。在另一方面，本公开提供制备带标签的核苷酸的方法，其包括:(a)提供含有多磷酸酯部分的核苷酸，所述多磷酸酯部分含有末端磷酸酯，其中所述末端磷酸酯与包含第一反应性官能团的接头结合；(b)提供包含第二反应性官能团的标签；和(c)使所述第一反应性官能团与所述第二反应性官能团反应以将所述核苷酸连接至所述标签，其中所述第一反应性官能团选自(i)硫醇、咪唑、胺、炔和二烯烃；所述第二反应性官能团选自(ii)马来酰亚胺、卤代乙酰胺、醛、异硫氰酸酯、异氰酸酯、乙烯基砜、叠氮和四嗪；或者反过来也可以(即所述第一反应性官能团选自(ii)，所述第二反应性官能团选自(i))。在一些实施方案中，所述第一反应性官能团不同于所述第二反应性官能团。在一些实施方案中，所述第一反应性官能团选自硫醇、咪本文档来自技高网...

【技术保护点】
带标签的核苷酸，其包含具有末端磷酸酯的多磷酸酯部分以及通过三唑、1,2‑二嗪、二硫化物、仲胺、腙、硫代乙酰胺或马来酰亚胺‑硫加成物共价结合至所述核苷酸的末端磷酸酯的标签。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.24 US 61/969,6281.带标签的核苷酸，其包含具有末端磷酸酯的多磷酸酯部分以及通过三唑、1,2-二嗪、二硫化物、仲胺、腙、硫代乙酰胺或马来酰亚胺-硫加成物共价结合至所述核苷酸的末端磷酸酯的标签。2.根据权利要求1所述的带标签的核苷酸，其中所述标签通过三唑共价结合至所述末端磷酸酯。3.根据权利要求2所述的带标签的核苷酸，其中所述三唑具有如下结构：其中R1包含所述标签，R2包含所述核苷酸；或者其中R1包含所述核苷酸，R2包含所述标签。4.根据权利要求2所述的带标签的核苷酸，其中所述三唑具有如下结构：其中R1和R3联合形成环状部分；并且其中联合的R1和R3包含所述标签，R2包含所述核苷酸；或者其中联合的R1和R3包含所述核苷酸，R2包含所述标签。5.根据权利要求1所述的带标签的核苷酸，其中所述标签通过1,2-二嗪共价结合至所述末端磷酸酯。6.根据权利要求1所述带标签的核苷酸，其中所述多磷酸酯部分在所述核苷酸的5’位置处。7.根据权利要求1-6中任一项所述的带标签的核苷酸，其中所述多磷酸酯部分包含至少3个磷酸酯，或者4-6个磷酸酯。8.根据权利要求1-7中任一项所述的带标签的核苷酸，其中所述标签包含核苷酸、寡核苷酸、肽、聚乙二醇(PEG)、寡糖、碳水化合物、肽核酸(PNA)、乙烯聚合物、其他水溶性聚合物或其任意组合。9.根据权利要求8所述的带标签的核苷酸，其中所述标签包含寡核苷酸。10.根据权利要求9所述的带标签的核苷酸，其中所述标签的所述寡核苷酸包含至少7个单体单元或至少30个单体单元。11.根据权利要求9所述的带标签的核苷酸，其中所述寡核苷酸包含非天然核苷酸。12.根据权利要求11所述的带标签的核苷酸，其中所述非天然核苷酸包含选自由L-核苷酸，2’,5’-键、α-D-核苷酸、非天然存在的核苷酸间连接、非天然存在的碱基、非天然存在的糖部分以及其任意组合组成的组，或者所述非天然核苷酸包含选自由硝基吡咯、硝基吲哚、水粉伞素(nebularine)、泽布拉林(zebularine)、苯和苯衍生物组成的组的非天然存在的碱基，或者所述非天然核苷酸包含选自磷酸三酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、硼磷酸酯、磷酰胺酯和吗啉基部分的非天然存在的核苷酸间连接。13.根据权利要求9-12中任一项所述的带标签的核苷酸，其中所述寡核苷酸的5’-端共价结合至多磷酸酯部分的末端磷酸酯。14.根据权利要求13所述的带标签的核苷酸，其中所述寡核苷酸包含其3’末端的化学修饰，所述其3’末端的化学修饰保护其免受核酸外切酶降解。15.根据权利要求14所述的带标签的核苷酸，其中所述其3’末端的化学修饰选自磷酸酯化和与C3-烷基至C12-烷基间隔子的共价结合。16.根据权利要求9-12中任一项所述的带标签的核苷酸，其中所述寡核苷酸的3’端共价结合至多磷酸酯部分的末端磷酸酯。17.根据权利要求16所述的带标签的核苷酸，其中所述寡核苷酸包含其5’末端的化学修饰，所述其5’末端的化学修饰保护其免受核酸外切酶降解。18.根据权利要求14所述的带标签的核苷酸，其中其5’末端的化学修饰选自磷酸酯化和与C3-烷基至C12-烷基间隔子的共价结合。19.根据权利要求9-18中任一项所述的带标签的核苷酸，其中所述寡核苷酸包含接头，所述接头包含花青染料部分或为Cy3部分的花青染料部分。20.根据权利要求9-19中任一项所述的带标签的核苷酸，其中所述寡核苷酸和/或接头包含间隔子部分，所述间隔子部分包含具有至少2至约12个碳的烷基。21.用于对包含权利要求1-20中任一项所述的带标签的核苷酸的核酸进行测序的试剂盒。22.制备带标签的核苷酸的方法，其包括：(a)提供(i)含有具有末端磷酸酯的多磷酸酯部分的核苷酸，其中所述末端磷酸酯与包含第一反应性官能团的接头结合，和(ii)包含第二反应性官能团的标签，其中(1)所述第一反应性官能团选自硫醇、咪唑、胺、炔和二烯烃，所述第二反应性官能团选自马来酰亚胺、卤代乙酰胺、醛、酯、异硫氰酸酯、异氰酸酯、乙烯基砜、叠氮和四嗪；或者(2)所述第一反应性官能团选自马来酰亚胺、卤代乙酰胺、醛、酯、异硫氰酸酯、异氰酸酯、乙烯基砜、叠氮和四嗪，所述第二反应性官能团选自硫醇、咪唑、胺、炔和二烯烃；以及(b)使所述第一反应性官能团与所述第二反应性官能团反应以将所述核苷酸连接至所述标签。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一反应性官能团选自硫醇、咪唑、胺、炔和二烯烃，所述第二反应性官能团选自马来酰亚胺、卤代乙酰胺、醛、酯、异硫氰酸酯、异氰酸酯、乙烯基砜、叠氮和四嗪。24.根据权利要求22所述的方法，其中：所述第一反应性官能团是炔，所述第二反应性官能团是叠氮；或者所述第一反应性官能团是叠氮，所述第二反应性官能团是炔。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述炔是环辛炔。26.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一反应性官能团选自马来酰亚胺、卤代乙酰胺、醛、异硫氰酸酯、异氰酸酯、乙烯基砜、叠氮和四嗪，所述第二反应性官能团选自硫醇、咪唑、胺、炔和二烯烃。27.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中通过包含铜、钌、银或其任意组合的非均相催化剂促进步骤(b)。28.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中不通过非均相催化剂促进步骤(b)。29.根据权利要求1-7中任一项所述的带标签的核苷酸或根据权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述标签选自表4所列出的标签。30.根据权利要求1-7中任一项所述的带标签的核苷酸或根据权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述带标签的核苷酸选自表4所列出的带标签的核苷酸。31.根据权利要求1-7中任一项所述的带标签的核苷酸或根据权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述标签选自表5所列出的标签。32.根据权利要求1-7中任一项所述的带标签的核苷酸或根据权利要求22-28中任一项所述的方法，其中所述标签包含选自表6所列出的化学修饰的化学修饰。33.根据权利要求19所述的带标签的核苷酸，其中所述带标签的核苷酸具有改善的聚合酶捕获速率。34.用于测定单链核酸的核苷酸序列的方法，其包括：(a)使所述单链核酸与核酸聚合酶和至少四种带标签的核苷酸在这样的条件下接触：如果所述带标签的核苷酸之一与单链核酸的核苷酸残基互补，所述核苷酸残基紧挨着与引物的3’末端核苷酸残基杂交的所述单链核酸的5’核苷酸残基，则允许所述核酸聚合酶催化将所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡尔·W·富勒，希夫·库马尔，静岳·具，兰德尔·戴维斯，罗杰·陈，
申请(专利权)人：哥伦比亚大学董事会，吉尼亚科技有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US