5′-核苷酸的生产方法技术

生产５′－核苷酸的方法，它包括：将核苷在有机溶剂中的悬浮液放置于不低于约２０℃的温度保存，然后对该得到的悬浮液进行核苷磷酸化。按照本发明专利技术，可以生产出高纯度、高收率的５′－核苷酸并能缩短反应时间，而且使核苷纯化过程中的杂质去除容易进行。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及改进的核苷磷酸化的方法，更具体地讲，涉及核苷磷酸化的方法，其中将核苷在有机溶剂中加热以改变其晶形，然后用其留下的未保护的羟基基团磷酸化。本专利技术方法提供经济地工业规模地生产5′-核苷酸(或其混合物)的途径;5′-核苷酸，特别是作为单体物质或包括次黄苷酸，鸟苷酸或胞苷酸或其它物质的混合物可用在调味品和药品中。常规核苷磷酸化的化学方法包括1)核苷与三氯氧化磷在磷酸三烷基酯中反应的方法(美国专利3413282)。2)用鸟苷和次黄苷混晶的方法(日本公开特许公报第167599/1984)。3)用鸟苷和次黄苷的混合磷酸化的方法(EPA-453597)。4)在磷酸化中使用矿化剂(metallizing agent)的方法(日本公开特许公报第80694/1984)。5)在磷酸化中使用铝化剂的方法(日本公开特许公报第163397/1984)。以下被认为是与本专利技术目的有关的核苷的化学磷酸化。当将核苷如次黄苷和鸟苷的混晶用三氯氧化磷在磷酸三乙酯存在下磷酸化时，在得到所需的5′-单核苷酸混合物的同时会产生二磷酸酯、次黄嘌呤、鸟嘌呤和其它的副产物，这是因为次黄苷和鸟苷的磷酸化的速度不同;具体来说，鸟苷的磷酸化速度约为次黄苷的1/3。抑制该副产物产生的途径是在磷酸化中使用鸟苷和次黄苷的混晶，如上述方法2。在另外的次黄苷或鸟苷的碱金属盐的磷酸化的方法如上述方法3中，后者的磷酸化继之以前者的添加以达到连续磷酸化。在核苷磷酸化的另一方法中，用矿化剂或铝化剂活化核苷的羟基基团然后磷酸化，如上述方法4和方法5。但从工业的角度就收率、副产物的产生、操作以及其它细节而论，还没有基于例如含给定比率的次黄苷和鸟苷的混合物或次黄苷和鸟苷的混晶的化学磷酸化从核苷生产核苷酸的令人满意的方法。因此，有必要开发出生产高纯度，高收率和最少副产物的，并缩短反应时间。本专利技术提供，它包括将核苷在有机溶剂中的悬浮液置于不低于约20℃的温度保存，然后将该得到的悬浮液进行核苷的磷酸化。在本专利技术中，核苷定义为通过糖苷键与嘌呤碱或嘧啶碱相连的糖，具体来讲是核糖核苷或脱氧核糖核苷。核糖核苷的例子包括次黄苷、鸟苷、胞苷、腺苷和尿苷。脱氧核糖核苷的例子包括脱氧次黄苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧尿苷。最好使用核糖核苷，优先选择次黄苷和鸟苷。作为原料核苷，可以使用上述核苷的单体或混合物。可以使用这些核苷的盐。核苷盐的例子包括与无机碱(例如碱金属如钠和钾，碱土金属如钙和镁，以及氨)形成的盐;与有机碱(例如三烷基胺如三甲胺和三乙胺，以及吡啶)形成的盐;与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐以及与有机酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐。优先选用次黄苷和鸟苷的混晶作原料核苷。该混晶可按公知方法制得。例如可用从含次黄苷和鸟苷的水溶液中结晶溶质的方法制得混晶(见日本特许公报第38199/1972)。如果这样，可以通过冷却、浓缩、加入晶种、加入不溶解核苷的亲水性溶剂(例如丙酮)、调节pH(从核苷溶解性强的pH3或pH3以下的酸性范围或pH9或pH9以上的碱性范围调至pH3-9之间)，或将这些方法结合起来制得结晶。最好是，用这样的方法使混合的核苷结晶从含核苷的溶液中结晶析出后，用通常所用的方法如真空抽吸、加压过滤、离心过滤或离心沉淀分出混晶，随后经例如减压加热干燥除去溶剂(例如水)，然后进行磷酸化。只要不干扰该反应，任何有机溶剂都可以用于本专利技术。该有机溶剂最好是极性溶剂例如磷酸三低级(C1-6)烷基酯如磷酸三甲酯或磷酸三乙酯，磷酸三低级(C1-6)烷氧基低级(C1-6)烷基酯如磷酸三甲氧乙酯或磷酸三乙氧乙酯，亚砜如二甲亚砜，或酰胺如二甲基甲酰胺或N-二甲基乙酰胺。这些有机溶剂可以单独使用或配合使用。在这些溶剂中，优先选用磷酸三低级(C1-6)烷基酯，磷酸三乙酯和磷酸三甲酯最好。尽管所用有机溶剂的重量依其类型变动，但宜选择在约为核苷重量的5-20倍、最好在约8-17倍之间。在本专利技术中，磷酸化按下述方法进行首先将核苷或其盐悬浮于有机溶剂中，然后将得到的悬浮液保持于不低于约20℃的温度。所述温度在约20-100℃为佳，约30-80℃更好，约40-60℃最好。该悬浮液在不低于20℃的温度的放置时间取决于该温度和上述原料核苷的重量。所述放置时间在约10-120分钟为佳，约10-60分钟更好，约10-20分钟最好。一般来讲，由于磷酸化是伴随核苷溶解的液-液反应。因此反应速度随用于该反应的核苷晶体的晶粒大小和晶形而变动。由于核苷晶粒越细，表面积越大，因此可以通过使核苷晶粒变小来增加表观反应速度。该核苷晶粒约1-1000μm为佳，约20-500μm更好。然而在本专利技术中，核苷晶体可以具任何的晶粒大小和晶形并以在有机溶剂中的核苷悬浮液的形式于不低于20℃的温度保存。因为在加热时，核苷晶体表面上变成无定形晶体。因为，类似于晶体转变，所以该核苷晶体的表面积增加并且与磷酸化剂的反应速度增加。随后，对得到的悬浮液进行核苷磷酸化。核苷磷酸化用磷酸化剂来完成。反应温度在约-30-10℃为佳，约0-10℃最好。用于本专利技术的磷酸化剂为磷酸化中常用的磷酸化剂，最好是三囟氧化磷(phosphorus oxyhalogenide)如三氯氧化磷或三溴氧化磷。在磷酸化时，最好使用转变成部分水合物的三卤氧化磷，而不直接用三囟氧化磷，因为转变成部分水合物的三卤氧化磷通常能对5′-单核苷酸的制备提供较高的选择性并减少如2′-或3′-磷酸酯和二磷酸酯这样的副产物的产生。为制得三卤氧化磷的水合物，将三卤氧化磷溶于上述的反应溶剂中，然后与少量水或醇如甲醇、乙醇或叔丁醇反应。所用的三卤氧化磷的摩尔量通常约为核苷的1-5倍，最好是约1.5-4倍。在该范围以外的用量一般不合乎需要，因为过小量会导致留有未反应的核苷，而过大量会导致二磷酸酯副产物产生并且降低所需的5′-单核苷酸的收率。通常根据磷酸化剂的类型或溶剂以及其它因素将加入量选在上述范围之内为宜。尽管反应时间随溶剂的种类、反应加速剂(例如极少量氢氧化钠等)的存在与否以及其它因素而改变，但一般约在30分钟到10小时之间。在本专利技术磷酸化的方法中，与常规磷酸化的方法相比，反应可以在较短的时间内完成。将如此得到的反应产物按常规方法与冷水(例如不高于约10℃，最好不高于约5℃)混合以水解未反应的磷酸化剂和得到的磷酰卤核苷(nucleoside phosphohalogenate)，得含5-核苷酸的溶液(水解液)。如此得到的5′-核苷酸可按常规方法纯化1)将水解液用氢氧化钠调节至pH约1.5，然后用活性炭处理的方法，2)用另外的有机溶剂提取分离反应溶剂，然后用碱如氢氧化钠中和残留物，然后用树脂吸附或结晶法纯化的方法，以及3)用另外的有机溶剂提取分离反应溶剂，然后用活性炭处理残留物，然后用这些纯化方法中的任何一个进行纯化，可按常规方法获得5′-磷酸核苷二钠的混晶。按照本专利技术，可以从核苷制得高纯度和高收率的5′-核苷酸，缩短了核苷磷酸化的时间而且使在核苷酸纯化过程中的杂质去除容易进行，三卤氧化磷的用量大大低于常规用量。下面将用以下实施例更详细的描述本专利技术。在下面的实施例中，IMPNa2代表次黄苷-5′-本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产５′－核苷酸的方法，它包括：将核苷在有机溶剂中的悬浮液放置于不低于约２０℃的温度保存，然后对该得到的悬浮液进行核苷磷酸化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：土师晃，波多野广行，池本朋已，北本芳文，
申请(专利权)人：武田麒麟食品株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]