一种H9N2亚型禽流感病毒三个基因的多重逆转录扩增方法技术

本发明专利技术目的是提供一种H9N2亚型禽流感病毒三个基因的多重逆转录扩增方法，可快速同时扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全长基因。?本发明专利技术首先提供能够同时扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全长基因的引物组，包括有一个通用的逆转录引物和用于扩增HA、NA、M基因的引物对，其中逆转录引物的核苷酸序列为SEQ?ID?NO:1，用于扩增A、NA、M基因的引物对的核苷酸序列分别为SEQ?ID?NO:2-7。本发明专利技术还提供能够同时扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全长基因的方法，可在一个反应中同时扩增出HA、NA、M三个基因。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
的，具体涉及一种H9N2亚型禽流感病毒三个基因的多重逆转录扩增方法，即用于同时扩增H9N2亚型禽流感病毒HA、NA、M三个全长基因的寡核苷酸引物组及使用该引物组的多重扩增方法。
技术介绍
禽流感是由流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类的一种以呼吸系统症状为主的禽类传染病。其中H9N2亚型低致病性禽流感病毒虽不及H5亚型禽流感病毒的致病力强，但由于其临床的分离率较高，且具有致病力变强造成免疫失败的趋势，所以，H9N2亚型禽流感病毒给养禽业带来的危害也不容忽视。 禽流感病毒基因组由8个负链单链RNA片段组成，分别为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因，这种核酸的多段性易使抗原性发生突变而不断变异，使得H9N2低致病性禽流感的致病力也随之变异。血凝素(HA)是构成病毒囊膜纤突的主要成分之一，在病毒吸附和穿膜过程中以及决定病毒致病力方面起着关键作用。神经氨酸酶(NA)是构成病毒囊膜纤突的另一部分。研究HA、NA基因发生的突变对掌握H9N2亚型禽流感病毒变异情况至关重要。基质蛋白(M)位于病毒囊膜的类脂双层内侧，核衣壳外侧，是维持病毒形态的结构蛋白，具有特异性，其抗原性的差异也是流感病毒分型依据之一。常规禽流感序列分析需对各个基因分别反转录和PCR扩增，若对大量毒株进行分析时用普通PCR方法扩增全基因则既花费大量时间，又耗费实验材料。因此，建立一种能同时扩增H9N2亚型禽流感病毒HA、NA、M三个全长基因的多重PCR方法具有重要的应用上的价值。而且目前多重RT-PCR方法均应用于禽流感病毒的检测或者分型，扩增出的目的片段仅是目的基因的一部分基因片段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种H9N2亚型禽流感病毒三个基因的多重逆转录扩增方法，可快速同时扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全长基因，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供能够同时扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全长基因的引物组，包括有一个通用的逆转录引物和用于扩增HA、NA、M基因的引物对，其中逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1，用于扩增A、NA、M基因的引物对的核苷酸序列分别为SEQID NO:2-7。本专利技术还提供能够同时扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全长基因的方法，包括如下的步骤:I)病原RNA的提取取H9N2亚型禽流感病毒感染的阳性鸡胚尿囊液400 u L，加入600 u L细胞裂解液和400 u L氯仿，颠倒混匀后，_20°C沉淀IOmin, 15，OOOg离心IOmin ;取上清加入到750 u L异丙醇中，颠倒混匀，_20°C沉淀30min，15，OOOg离心IOmin ;弃去上清液，用75%的冷乙醇洗2遍，弃去上清液，并吸干残余液体；2)反转录采用20ii L 的反转录体系:5XRT buffer4 y L，2.5mmol/L 的 dNTPs 2u L,40U/U L RNA酶抑制剂0.5 ii L，200U/ u L M-MLV反转录酶0.5 y L，25 y mol/L的通用反转录引物1.5 ii L，用DEPC水补足体积至20 u L，42°C水浴I小时；3)多重RT-PCR扩增HA、NA、M全长基因采用总体积为30 ii L的多重PCR反应体系:10XPCR Buffer 3 u L, 25mMMgCl24ii L，2.5mmol/L 的 dNTPs 5 y L，Taq 酶 0.5 y L，基因上下游引物各 0.5 y L，RT 产物2 ii L，用DEPC水补足至30 u L，混匀离心后进行PCR，循环条件为94°C预变性5min后，94°C变性30S，60°C退火40S，72°C延伸90S，共循环30次，最后72°C终延伸IOmin完成扩增。经1%琼脂糖凝胶电泳可见三个目的条带，其中HA全长基因扩增出1742bp的特异性条带，NA全长基因扩增出1410bp的特异性条带，M全长基因扩增出1027bp的特异性条带。本专利技术的引物组及建立的多重扩增方法可在一个反应中将三个基因同时扩增出来，且设计的多重引物在多重PCR反应中无非特异性扩增，具有很好的应用价值。附图说明 图1:本专利技术方法的扩增结果的电泳图；其中l、Marker DL2000 2、H9N2 禽流感病毒；图2:本专利技术方法的特异性试验电泳图，其中1、Marker DL2000 2、H9N2禽流感病毒3、传染性支气管炎病毒4、新城疫病毒5、传染性法氏囊病毒；图3:本专利技术方法的敏感性试验的电泳图，其中:1、10ii g/ ii I cDNA ； 2、I U g/ U I cDNA ;3、10 U g/ U I cDNA cDNA ；4、10_2ii g/ii I cDNA ;5、10_3ii g/ii I cDNA ；6,Marker DL2000。具体实施例方式下面对本专利技术的引物组及扩增方法进行详细的描述。(I)引物设计由于H9N2亚型禽流感病毒HA、NA、M全长基因在5’端碱基同源性很高，因此设计引物时既要防止交叉扩增，又要保持引物的普遍性，引物序列长度至关重要，而申请人通过序列的比对，筛选出了各自的特异引物，从而促成了本专利技术。根据H9N2亚型的HA全基因序列、NA全基因序列、M全基因序列，运用DNAStar软件分析其同源性，再使用Primer Premier 5.0软件,在全基因的5’端和3’端设计特异性引物及通用反转录引物。引物序列如下:权利要求1.一种扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全长基因的引物组，其特征在于，包括有一个通用的逆转录引物和用于扩增HA、NA、M基因的引物对，其中逆转录引物的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1，用于扩增A、NA、M基因的引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID N0:2_7。2.一种同时扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全长基因的方法，包括如下的步骤: 1)病原RNA的提取 取H9N2亚型禽流感病毒感染的阳性鸡胚尿囊液400 u L，加入600 u L细胞裂解液和400 V- L氯仿,颠倒混勻后，_20°C沉淀IOmin, 15, OOOg离心IOmin ;取上清加入到750 ii L异丙醇中，颠倒混匀，_20°C沉淀30min，15，OOOg离心IOmin ;弃去上清液，用75%的冷乙醇洗2遍，弃去上清液，并吸干残余液体； 2)反转录 采用 20 ii L 的反转录体系:5 X RT buffer4 u L, 2.5mmol/L 的 dNTPs 2 u L, 40U/ u LRNA酶抑制剂0.5iiL，200U/iiL M-MLV反转录酶0.5 y L，25 y mol/L的通用逆转录引物1.5 ii L，用DEPC水补足体积至20 u L，42°C水浴I小时; 3)多重RT-PCR扩增HA、NA、M全长基因 采用总体积为30iiL的多重PCR反应体系:10XPCR Buffer 3u L,25mM MgCl24u L,2.5mmol/L 的 dNTPs 5yL，Taq 酶 0.5 y L，基因上下游引物各 0.5 y L，RT 产物 2 y L，用 DEPC水补足至30 u L，混匀离心后进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、M三个全长基因的引物组，其特征在于，包括有一个通用的逆转录引物和用于扩增HA、NA、M基因的引物对，其中逆转录引物的核苷酸序列为SEQ?ID?NO:1，用于扩增A、NA、M基因的引物对的核苷酸序列分别为SEQ?ID?NO:2?7。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张乐萃，陈欣，尹燕博，单虎，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：