本发明专利技术公开了针对甲型流感病毒H7N2抗原表位的纳米抗体以及编码该纳米抗体的基因序列，同时还公开了能够表达流感病毒H7N2纳米抗体的宿主细胞。本发明专利技术首次获得甲型流感病毒H7N2的纳米抗体及其编码序列，所述纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，特异识别甲型流感病毒H7N2，检测灵敏度高，用于流感病毒H7N2检测表现出良好的线性关系，具有用于甲型H7N2流感诊断的应用价值。
H7N2 antibody of avian influenza A and its application
The invention discloses a nanometer antibody for a H7N2 antigen epitope of influenza A virus and a gene sequence encoding the same, and also discloses a host cell capable of expressing the H7N2 antibody of influenza virus. The invention first obtained nano antibody of influenza A virus H7N2 and its encoding sequence, the nano antibody can be efficiently expressed in Escherichia coli, specific identification of influenza A virus H7N2, high detection sensitivity for detection of influenza virus H7N2 showed a good linear relationship, with the diagnostic value of H7N2 for swine flu.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药
，具体涉及针对甲型禽流感H7N2的纳米抗体、其编码序列及其应用。
技术介绍
甲型流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）基因组为八个分节段的负链RNA，属于正粘病毒科，共编码12-13种蛋白，根据两种表面蛋白HA（血凝素）和NA（神经氨酸酶）可分为不同的血清型，现已从禽类中分离到81种不同血清亚型的禽流感病毒，而且还有新的HA和NA不断被发现，禽流感病毒的多型性给防治禽流感带来极大难度。按照致病性大小，禽流感病毒可以分为高致病性（HPAIV）、低致病性(LPAIV)和非致病性三类，非致病性禽流感不会引起明显症状；低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，导致食量减少，产蛋量下降，甚至零星死亡；高致病性禽流感危害最为严重，传播快，发病率和死亡率均高，被世界动物卫生组织列为A类动物疫病，我国亦将其列为一类动物疫病。与所有亚型的AIVs一样，H7亚型AIVs也可由禽类直接传给了人，但对人感染H7亚型的禽流感病毒关注度相对却很低。H7N2在美国东北部的活禽市场流行数十年，2002年在火鸡中大规模暴发80位职业人群均出现流感样症状，2003年禽流感病毒H7N2再次爆发。2013年3月31日中国的上海和安徽两地共发现3例人感染新型重配H7N9病毒的报道，其中2人死亡1人重症提醒我们H7亚型禽流感病毒对公众健康的威胁不容忽视。有效的疫苗针对禽流感可提供最好的保护，但目前的疫苗技术限制了短期内满足大量有效疫苗需求的生产。对HPAIV H7N2病毒而言，由于欧亚地区流行不同支系的H7N2病毒，选择群特异性的疫苗株对于H7N2病毒疫苗的设计和选择来说是个很大的挑战。不同抗原性的H7谱系均能使人致病，近年来从人群中分离到的北美谱系H7N2、H7N3以及欧亚谱系H7N2 、H7N3的人分离株可供选择合适的疫苗株，但针对两个谱系的人用H7疫苗仍在研制中。抗病毒药物是治疗流感病毒感染非常有效的方法之一，但H7有耐药株出现，体外实验表明2003年荷兰暴发的H7对M2离子通道抑制剂金刚烷胺类耐药，同样北美谱系的H7也有耐金刚烷胺的报道，因此对耐药株的监测与新型药物的研发同样重要。纳米抗体在基础研究、新药开发以及疾病的诊断和治疗以及食品科学领域具有广阔的应用前景，已经成为一个重要研究热点。利用抗体技术获得针对甲型H7N2流感病毒表位的纳米抗体，从而应用于临床诊断和靶向治疗具有广阔前景。目前尚无针对甲型H7N2流感病毒表位的纳米抗体报导。
技术实现思路
本专利技术的目的一方面是提供一种针对甲型流感病毒H7N2的纳米抗体。本专利技术提供的一种针对甲型流感病毒H7N2的纳米抗体（也称为重链抗体，VHH），包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4。所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。优选地，所述的H7N2纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。纳米抗体(nanobody，Nb)是近年来发现的一种新型抗体，其抗原结合位点仅由重链的可变区( variable domain of the heavy chain of HCAbs，VHHs) 构成，也称为VHH抗体，是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子片段，具有相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、表达量高及免疫原性低等特点，较常规抗体用途更广。与具有重链和轻链4条多肽链组成的常规抗体分子不同，重链抗体由两条同源的重链肽段组成，重链分子只包含可变区、CH2区和CH3区，相对分子质量为90kDa，远小于常规的IgG抗体分子150KDa。本专利技术第二方面，提供的一种针对甲型流感病毒H7N2表面抗原的重链抗体VHH，包括一条具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的VHH链。本专利技术第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本专利技术所述的甲型流感病毒H7N2的重链抗体VHH。优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQ ID NO：9。本专利技术的第四方面，提供了一种表达载体，它含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。作为优选，其为pMECS、 pET32a或pET28a。本专利技术的第五方面，提供了一种宿主细胞，其含有所述的表达载体，所述甲型流感病毒H7N2的纳米抗体。作为优选，其为WK6、TG1或BL21。本专利技术的第六方面，提供了一种检测甲型流感病毒H7N2的试剂盒，其包含修饰或未修饰的所述纳米抗体，优选的，所述修饰为偶联HRP、FITC或生物素。本专利技术的第七方面，提供了本专利技术所述的甲型流感病毒H7N2的重链抗体VHH在用于制备诊断甲型H7N2流感制剂的用途。禽流感的早期诊断对于控制疫情有重大意义，甲型流感病毒H7N2的纳米抗体在禽流感的诊断中发挥作用，从而对疫情的控制产生积极影响。与现有技术相比，本专利技术的优点如下：本专利技术使用灭活的甲型H7N2流感病毒免疫双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对甲型流感病毒H7N2的重链抗体VHH噬菌体文库。随后试验中将灭活的甲型H7N2流感病毒偶联在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体噬菌体文库，从而获得了针对甲型H7N2流感病毒的特异性纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。获得纳米抗体后，对其进行生物素化，并将生物素化的纳米抗体与链霉亲和素化的微孔板偶联，同时捕获抗原，另外一株识别抗原另一表位且偶联HRP的纳米抗体进行显色，得到甲型流感H7N2的检测灵敏度为2.97 ng/ml，检测线性范围为0-100 ng/ml，线性方程为y= 0.0105x + 0.3229，相关系数为0.9952，用此方法对流感病毒H7N2进行检测表现出良好的线性关系，为禽流感H7N2的纳米抗体应用于临床诊断以及诊断试剂盒的开发奠定基础。附图说明图1是纳米抗体的基因电泳图，1、DNA分子标准（bp）；2、纳米抗体DNA片段，大小约为500bp；图2是构建的单域抗体文库的插入率检测结果，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为DNA分子标准，其余孔道为从所建单域抗体文库中随机挑取单克隆检测插入片段的PCR产物，经检测，该文库的插入率为100％；图3是经镍柱纯化后，得到的H7N2纳米抗体的SDS-PAGE的电泳图，其表达的蛋白对应SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。图4是利用双抗夹心法检测甲型流感H7N2的原理图。图5是利用双抗夹心法检测甲型流感H7N2的灵敏度和检测线性。具体实施方式本专利技术公开了一种甲型禽流感H7N2的纳米抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法本文档来自技高网...
【技术保护点】
甲型流感病毒H7N2的纳米抗体，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。
【技术特征摘要】
1.甲型流感病毒H7N2的纳米抗体，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，其具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。3.编码权利要求1或2所述的甲型流感病毒H7N2的纳米抗体的DNA分子。4.根据权利要求3所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：万亚坤，龚雪，欧卫军，王保君，
申请(专利权)人：北京科卫临床诊断试剂有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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