全人源化抗狂犬病毒的中和性抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种全人源化抗狂犬病毒的中和型抗体，编码该抗体及其结合片段的DNA序列，以及包含所述DNA的宿主细胞和表达载体。本发明专利技术还公开了具有高亲和力的全人源抗狂犬病病毒抗体的制备方法，以及所述抗体在治疗和/或预防狂犬病的药物中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术本专利技术属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及一种全人源化抗狂犬病毒的中和性抗体。
技术介绍
狂犬病被动免疫制剂能够中和伤口局部的狂犬病毒，阻止病毒扩散并侵入神经系统，其半衰期长达14～21天，能够有效发挥治疗或紧急预防狂犬病的作用。最早应用狂犬病被动免疫制剂治愈患者的例子可以追溯到1891年，但是在几十年后人类才生产出第一个商品化的人用抗狂犬病免疫血清。这种人用抗狂犬病免疫血清来源于马，由于为异源性血清，使用后不良反应可高达40％以上。目前市场上主要产品还是马源抗狂犬病血清球蛋白(ERIG)，虽然为降低ERIG不良反应改进了生产工艺，但是其仍存在明显的副反应，且对某些疫苗的抗体反应有抑制作用。针对这一问题，美国免疫实践咨询委员会(ACIP)建议选用人源抗狂犬病血清球蛋白(HRIG)。由于HRIG来源于人而受到极大的限制，且存在潜在的病原污染风险，临床应用也受到了极大地限制。事实上在狂犬病毒流行地区尤其是狂犬病高发的发展中国家，无论是HRIG还是ERIG均远远无法满足市场需求，因此寻找可靠的RIG替代品是目前研究的首要目标。应用单克隆抗体技术开发抗狂犬病病毒特异性的单克隆抗体(monoclonalantibodies，mAbs)防治狂犬病可以克服多抗血清的诸多弊端，应用前景广阔。1978年首次通过B淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术获得了能够保护动物抵抗致死性狂犬病毒攻击的抗狂犬病毒mAbs，此后多种抗狂犬病毒mAbs相继问世。2007年，Muhamuda等获得了中和滴度及蛋白活性高于市场上的ERIG2000倍的鼠源性抗狂犬病毒mAbs，有望进一步研究以应用于人群暴露后预防。目前有部分抗狂犬病病毒特异性的mAbs进入临床研究阶段的报道，但至今仍没有药物被批准上市。随着抗体技术的发展，制备抗体的方法已由多克隆抗体技术和单克隆抗体技术，发展为基因工程抗体技术。基因工程抗体以其对人体毒副作用小、人源化和高度特异性，越来越显示其优势。针对狂犬病毒糖蛋白的单克隆抗体Mab57是目前研究最为深入的人源杂交瘤单克隆抗体。但早期的基因工程抗体也存在不可忽视的缺点，如基因取自杂交瘤细胞，生产抗体的流程复杂，嵌合抗体和人源化抗体不能完全解决HAMA反应，难以对抗体进行改造获得高亲和力抗体等。Mab57因而一直未能完成临床前研究。随着人源抗体的技术的开发，如噬菌体展示、核糖体展示、酵母展示或是使用转基因技术产生的具有人免疫球蛋白基因的小鼠均能获得高亲和力人源抗体。近些年，越来越多的研究者在基因工程抗体的研究中通过从人B细胞中筛选抗体的方法，获得全人源的单克隆抗体。由于这些抗体是在人体内自然产生的，在安全性、有效性和与人类疾病的相关性都体现了巨大的优势。噬菌体抗体库、B细胞永生化和单细胞克隆表达是3种目前常用的从B细胞中获得全人源单克隆抗体的方法。随着研究的继续和深入，各种新型抗狂犬被动免疫制剂的商品化生产将成为可能，人源或全人源单克隆抗体有望很快用于临床治疗。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的之一，提供一种全人源的抗狂犬病毒的单克隆抗体。本专利技术的目的之二，提供一种治疗狂犬病的药物组合物和手段。本专利技术的目的之三，提供一种检测狂犬病毒的工具和手段。本专利技术目的之四，提供一种诊断狂犬病的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供了一种抗狂犬病毒的单克隆抗体TRN079，其特征在于，所述单克隆抗体包括轻链CDR1-3和重链CDR1-3氨基酸序列；所述轻链CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；所述轻链CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；所述轻链CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；所述重链CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示；所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。进一步，所述抗体轻链的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。进一步，所述抗体重链的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。进一步，所述抗体分子选自具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段。本专利技术提供了一种上述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)获得具有编码上述抗体的DNA分子；(2)将步骤(1)所述的DNA分子与表达载体相连，构建重组表达载体；(3)将步骤(2)的重组表达载体，共转染转入宿主细胞后，表达，纯化，即得。本专利技术中抗体分子可仅包含重链或轻链多肽，在这种情况下，仅需将重链或轻链多肽编码序列用于转染宿主细胞。对于产生包含重链和轻链的产物，可使用两种载体(编码轻链多肽的第一载体以及编码重链多肽的第二载体)转染细胞系。或者，可使用单一载体，载体包括编码重链和轻链多肽的序列。本专利技术提供了一种分离的DNA序列，所述DNA序列编码上述所述的抗体的重链和/或轻链。本专利技术提供了一种克隆或表达载体，所述克隆或表达载体包含一种或多种DNA序列，所述DNA序列编码上述所述的抗体的重链和/或轻链。本专利技术提供了上述单克隆抗体在制备用于检测狂犬病毒的工具中的应用。进一步，所述工具包括试剂盒、试纸、芯片等。其中，所述芯片包括蛋白质芯片；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的上述单克隆抗体；所述蛋白免疫检测试剂盒；所述蛋白免疫检测试剂盒包括上述单克隆抗体。本专利技术提供了一种检测狂犬病毒的工具，所述工具包含上面所述的单克隆抗体。本专利技术提供了上面所述的单克隆抗体在制备治疗和/或预防狂犬病的药物组合物中的用途。本专利技术提供了一种制备上述抗体的方法，所述方法包括如下步骤：(1)分离狂犬病毒阳性患者血清的静脉血中的单个核细胞，之后利用流式细胞术进行细胞分选，分选出单个记忆性B细胞；(2)利用单细胞RT-PCR扩增步骤(1)获得的单个B细胞中的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段；(3)将步骤(2)获得的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段融合到含有人类抗体恒定区的表达载体中构建重组表达载体；(4)将步骤(3)的重组表达载体共转染入宿主细胞后表达、纯化，获得具有结合活性和中和活性的本专利技术的全人源抗狂犬病毒的单克隆中和抗体。本专利技术还提供了一种检测狂犬病毒的方法，所述方法包括以下步骤：(1)获取样品；(2)将步骤(1)获得的样品处理后与权利要求1-4任一项所述的抗体反应；(3)检测样品与抗体的中和效应。本专利技术中“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。克隆抗体在本专利技术中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。“完整抗体”在本专利技术中指包含两个抗原结合区及Fc区的抗体。优选的是，完整抗体具有功能性Fc区。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全人源抗狂犬病毒的单克隆抗体TRN079，其特征在于，所述单克隆抗体包括轻链CDR1‑3和重链CDR1‑3氨基酸序列；所述轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

【技术特征摘要】
1.一种全人源抗狂犬病毒的单克隆抗体TRN079，其特征在于，所述单克隆抗体包括轻链CDR1-3和重链CDR1-3氨基酸序列；所述轻链CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；所述轻链CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；所述轻链CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；所述重链CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示；所述重链CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。2.根据权利要求1所述的全人源单克隆抗体，其特征在于，所述抗体轻链的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。3.根据权利要求2所述的全人源单克隆抗体，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖化新，袁晓辉，王月明，
申请(专利权)人：广州泰诺迪生物科技有限公司，暨南大学，珠海泰诺麦博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44