抗狂犬病毒卵黄抗体的制备工艺，包括如下步骤：免疫接种疫苗鸡的选择-免疫接种疫苗剂量-免疫程序-卵黄分离方法与技巧-卵黄抗体水溶性组分液WSF制备-卵黄抗体分离提取-卵黄抗体提取物无菌处理-PEG溶液配制-透析袋处理。本发明专利技术卵黄抗体作为一种易获得、廉价的多克隆抗体,IgY具有较好的抗病毒效果，而且其IgY也是没有毒副作用的，提纯的IgY是现代理想的免疫增强剂和治疗剂，制备方便，安全可靠，抗狂犬病毒卵黄抗体是将狂犬疫苗免疫禽类，在狂犬病毒刺激下由禽类B淋巴细胞产生并转移到卵黄中的抗狂犬病毒多克隆抗体，可用于人群狂犬病的预防和治疗，特别是从事犬暴露高危人群的预防和被犬咬伤后的紧急预防。
【技术实现步骤摘要】
抗狂犬病毒鸡卵黄抗体的制备工艺
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种抗狂犬病毒卵黄抗体的制备工艺。
技术介绍
狂犬病俗称疯狗症，又名恐水症，是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，病原体为狂犬病病毒。狂犬病毒通常通过患狂犬病动物的带毒唾液进入咬伤伤口，或经粘膜接触感染。高度嗜神经的狂犬病毒在肌肉组织中复制，并进入周围神经，由周围神经系统进入脊髓，最终上行进入大脑，在中枢神经系统(CNS)中传播后，病毒从CNS沿着神经按“离心”方向回传到包括唾液腺在内的各种器官，在唾液腺被排放到唾液中，再经由咬伤伤口或被带毒唾液污染的粘膜而传播到下一个受害者。狂犬病通常的死亡原因都是由于中枢神经(脑-脊髓)被病毒破坏，最终死于自主神经系统受损导致的脏器衰竭、呼吸衰竭。据统计每年至少有55000人死于狂犬病。95%病死案例发生在非洲和亚洲。 没有接受狂犬疫苗免疫的感染者，当神经症状出现后几乎必然死亡，接种疫苗后其诱发机体产生抗狂犬病毒抗体需要一定时间，不及时主动免疫会导致狂犬病毒在神经系统的蔓延而导致死亡；另外通过注射狂犬免疫球蛋白进行被动免疫，目前市场上的狂犬免疫球蛋白价格较贵不适合在普通人群中的应用。 IgY及理化性质:禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫系统，分别受胸腺和法氏囊的控制。当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体(yolkantibody, IgY), IgY的理化性质与哺乳动物的IgG相似。正常鸡IgY的分子量约为180KDa，由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成，分子量分别为60-70KDa和22-30KDa。其等电点约为5.2。 IgY与一般哺乳动物IgG相比，IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。在低于75°C条件下，IgY具有良好的热稳定性。IgY制剂在4°C贮存5年或在室温贮存6个月其活性仍无明显变化或下降，65°C时可保持24h以上，70°C时加热90min后其活性才明显下降60°C , 30min条件下巴氏消毒不影响IgY，高于80°C,大部分IgY失去活性。IgY对胃蛋白酶有较高的抵抗力，但对胰蛋白酶十分敏感。将胃蛋白酶和IgY在PH2.0温育Ih后，几乎所有活性丧失，但在PH4.0时Ih后可保持91%的活性，甚至温育1h后仍有63%活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳酶温育8h，活性分别保持39%和41%。 IgY的作用机理: 特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区(Fe部分)留在肠内。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开一种抗狂犬病毒卵黄抗体的制备工艺，用于人群狂犬病的预防和治疗，特别是从事犬暴露高危人群的预防和被犬咬伤后的紧急预防。 抗狂犬病毒卵黄抗体的制备工艺，包括如下步骤:O免疫接种疫苗鸡的选择:选择健康状态良好，17-18周龄粤禽鸡；2)免疫接种疫苗剂量:每只鸡免疫接种人用狂犬病毒疫苗每次量为0.5ml ；3)免疫程序:免疫途径为皮下注射，免疫次数为3次，免疫间隔时间为7天，免疫注射技巧为3点注射；4)卵黄分离方法与技巧:用75%酒精浸泡鸡蛋5-10分钟，取出鸡蛋用清水冲洗，用无菌纱布将蛋壳擦干，打开蛋壳一个小孔，让蛋清缓慢流出，顺流尽蛋清，打开蛋壳，小心将整个蛋黄移至灭菌滤纸上，来回流动，除尽蛋清，取蛋黄放入量杯或量筒，记录卵黄量；5)卵黄抗体水溶性组分液WSF制备:按卵黄量的8倍加入灭菌的双蒸水，用0.1M HCl调卵黄稀释液PH为5.1，放置在4°C环境下搅拌8小时取出，在4°C环境下将卵黄稀释液放入离心机中以10000-12000转/分钟，离心15分钟，收取得卵黄抗体水溶性组分液上清液；6)卵黄抗体分离提取方法:将卵黄抗体水溶性组分液上清液加入8%PEG6000100ml,搅拌30分钟，然后在4°C环境下放入离心机中以10000-12000转/分钟，离心15分钟，收集沉淀，去上清液，沉淀装入透析袋透析；7)卵黄抗体提取物无菌处理:将直径0.22Mffl过滤膜装入滤器，高压蒸汽灭菌后抗体提取物过滤，即为无菌抗体，将卵黄抗体置于_20°C保存备用，保存期2年； 8)PEG 溶液配制:用 PBS (0.01mol/L PH7.4)配制； 9)透析袋处理:将透析袋放入300ml透析处理液(2%NaHC03、lmmol/LEDTA, PH 8.0)中煮沸10分钟后，以蒸馏水彻底漂洗后再用300ml (PH 8.0)lmmol/LEDTA液中煮沸10分钟，最后用灭菌的双蒸水里外彻底冲洗。 所述步骤2)打开蛋壳一个小孔后，从小孔内注入少量无菌NS洗净蛋清。 所述步骤3)免疫注射技巧3点注射为，胸部一点，两翼下各一点。 采用上述技术方案的有益效果是:本专利技术卵黄抗体作为一种易获得、廉价的多克隆抗体，目前已得到越来越广泛的应用，已有研究显示，IgY具有较好的抗病毒效果，抗轮状病毒卵抗体主要是通过改变病毒表面的构型，阻止病毒吸附于机体细胞以及增强巨噬细胞的吞噬作用，鸡蛋作为正常的膳食成分不仅是一种营养健康和经济实惠的食品，而且其IgY也是没有毒副作用的，提纯的IgY是现代理想的免疫增强剂和治疗剂，制备方便，安全可靠，本研究认为，口服抗狂犬病毒特异性IgY的被动免疫能够及时中和体内狂犬病毒，可用于被病兽咬伤后的紧急治疗。 本专利技术是将狂犬疫苗免疫禽类，在狂犬病毒刺激下由禽类B淋巴细胞产生并转移到卵黄中的抗狂犬病毒多克隆抗体，可用于人群狂犬病的预防和治疗，特别是从事犬暴露高危人群的预防和被犬咬伤后的紧急预防。 【具体实施方式】 一、免疫家禽: 1)免疫原制备:免疫原为人用狂犬病疫苗；2)免疫家禽:选择17-18周龄粤禽鸡四只，将免疫原注射到粤禽鸡体内，每只免疫原注射量0.5ml，注射途径为多点注射:胸部一点，两翼下各一点共三点注射，首次免疫后的第7及第14天进行加强免疫，免疫剂量与方法与首次免疫相同；3)收集鸡蛋:免疫结束后收集鸡蛋，收集从最后一次免疫算起每日鸡蛋，将鸡蛋编号并做好记录，并于4°C冰箱保存备用，收集粤禽鸡未免疫前鸡蛋为阴性对照。 二、提取卵黄抗体:1).将收集的鸡蛋用75%酒精浸泡5-10分钟；2).将鸡蛋取出，用清水冲洗，用无菌纱布将蛋壳擦干；3).将鸡蛋蛋壳用剪刀打开一个小孔，让蛋清缓慢流出，直至流尽蛋清，并从小孔内注入少量无菌NS将残余蛋清洗净；4).把只剩蛋黄的蛋壳用小镊子轻轻打开，小心将整个卵黄移至灭菌滤纸上，来回流动，除尽蛋清；5).把卵黄加入无菌量杯，记录卵黄量(大约8-10g)，然后加入8倍灭菌的双蒸水与量杯中制成卵黄稀释液；6).用0.1M HCl小心调节卵黄稀释液的PH值，使其PH为5.1，然后将其置4°C冰箱本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗狂犬病毒卵黄抗体的制备工艺，其特征在于：该工艺包括如下步骤：1）免疫接种疫苗鸡的选择：选择健康状态良好，17‑18周龄粤禽鸡； 2）免疫接种疫苗剂量：每只鸡免疫接种人用狂犬病毒疫苗每次量为0.5ml；3）免疫程序：免疫途径为皮下注射，免疫次数为3次，免疫间隔时间为7天，免疫注射技巧为3点注射；4）卵黄分离方法与技巧：用75%酒精浸泡鸡蛋5‑10分钟，取出鸡蛋用清水冲洗，用无菌纱布将蛋壳擦干，打开蛋壳一个小孔，让蛋清缓慢流出，顺流尽蛋清，打开蛋壳，小心将整个蛋黄移至灭菌滤纸上，来回流动，除尽蛋清，取蛋黄放入量杯或量筒，记录卵黄量；5）卵黄抗体水溶性组分液WSF制备：按卵黄量的8倍加入灭菌的双蒸水，用0.1M HCl调卵黄稀释液PH为5.1，放置在4℃环境下搅拌8小时取出，在4℃环境下将卵黄稀释液放入离心机中以10000‑12000转/分钟，离心15分钟,收取得卵黄抗体水溶性组分液上清液；6）卵黄抗体分离提取方法：将卵黄抗体水溶性组分液上清液加入8%PEG6000 100ml，搅拌30分钟，然后在4℃环境下放入离心机中以10000‑12000转/分钟，离心15分钟,收集沉淀，去上清液，沉淀装入透析袋透析；7）卵黄抗体提取物无菌处理：将直径0.22µm过滤膜装入滤器，高压蒸汽灭菌后抗体提取物过滤，即为无菌抗体，将卵黄抗体置于‑20℃保存备用，保存期2年；8）PEG溶液配制：用PBS(0.01mol/L PH7.4)配制；9）透析袋处理：将透析袋放入300ml透析处理液（2%NaHCO3、1mmol/L EDTA,PH 8.0）中煮沸10分钟后，以蒸馏水彻底漂洗后再用300ml（PH 8.0）1mmol/LEDTA液中煮沸10分钟，最后用灭菌的双蒸水里外彻底冲洗。...
【技术特征摘要】
1.抗狂犬病毒卵黄抗体的制备工艺，其特征在于:该工艺包括如下步骤: O免疫接种疫苗鸡的选择:选择健康状态良好，17-18周龄粤禽鸡； 2)免疫接种疫苗剂量:每只鸡免疫接种人用狂犬病毒疫苗每次量为0.5ml ； 3)免疫程序:免疫途径为皮下注射，免疫次数为3次，免疫间隔时间为7天，免疫注射技巧为3点注射； 4)卵黄分离方法与技巧:用75%酒精浸泡鸡蛋5-10分钟，取出鸡蛋用清水冲洗，用无菌纱布将蛋壳擦干，打开蛋壳一个小孔，让蛋清缓慢流出，顺流尽蛋清，打开蛋壳，小心将整个蛋黄移至灭菌滤纸上，来回流动，除尽蛋清，取蛋黄放入量杯或量筒，记录卵黄量； 5)卵黄抗体水溶性组分液WSF制备:按卵黄量的8倍加入灭菌的双蒸水，用0.1M HCl调卵黄稀释液PH为5.1，放置在4°C环境下搅拌8小时取出，在4°C环境下将卵黄稀释液放入离心机中以10000-12000转/分钟，离心15分钟，收取得卵黄抗体水溶性组分液上清液； 6)卵黄抗体分离提取方法:将卵黄抗体水溶性组分液上清液加入8%PEG60...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭锦锦，孙万邦，唐艳丽，王胜香，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。