本发明专利技术涉及动物疫病诊断技术领域，更具体的讲是一种用于检测羊的伪狂犬病毒抗体ELISA试剂盒，本发明专利技术提供的ELISA试剂盒包括包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、酶标结合物、20×浓缩洗涤液、底物液、终止液、封口胶、自封袋、使用说明书，所述的试剂盒能快速、灵敏、准确的检测羊体内的PRV抗体水平，填补了国内外该领域的空白。所述的试剂盒用以代替病毒中和试验等传统的血清学方法，用以实现敏感性高、特异性强、稳定性好的高通量大规模的羊体内PRV抗体的检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及动物疫病诊断
，更具体的讲是一种用于检测羊的伪狂犬病毒抗体ELISA试剂盒，本专利技术提供的ELISA试剂盒包括包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、酶标结合物、20×浓缩洗涤液、底物液、终止液、封口胶、自封袋、使用说明书，所述的试剂盒能快速、灵敏、准确的检测羊体内的PRV抗体水平，填补了国内外该领域的空白。所述的试剂盒用以代替病毒中和试验等传统的血清学方法，用以实现敏感性高、特异性强、稳定性好的高通量大规模的羊体内PRV抗体的检测。【专利说明】—种检测羊伪狂犬病毒抗体的ELISA试剂盒
本专利技术涉及动物疫病诊断
，尤其涉及一种检测羊的伪狂犬病毒抗体的间接ELISA试剂盒，以此对羊群的伪狂犬病毒抗体水平及疫病分布与流行情况进行监测。
技术介绍
伪狂犬病，亦称奥耶兹基氏病，简称PRV，是由疱疹病毒科的甲型疱疹病毒引起的。该病毒可感染人类和无尾猿以外的所有哺乳动物的中枢神经系统和其它器官，如呼吸道。该病可危害各阶段的羊群，死亡率高达100%，临床上以发热、奇痒以及脑脊髓炎症状为特征。该病在世界范围内发生且广泛流行，近年来随着我国肉羊产业的发展和羊频繁流动，本病给养羊业带来了巨大的经济损失。 gD是PRV的主要结构蛋白，它不仅诱导体液免疫，而且诱导细胞免疫，同时是病毒粒子表面的病毒感染细胞的主要分子，在病毒吸附和侵入宿主细胞过程中发挥重要作用，为病毒复制的必需基因，是一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标，能诱导较好的保护反应，抵抗PRV强毒株攻击，因此gD被作为PRV特异性抗原研究的首选蛋白。 目前，一般采用病毒中和试验、乳胶凝集或ELISA方法检测伪狂犬病毒的抗体。国内外已有许多商品化的检测试剂盒可供使用，但检测对象多针对最为普遍和易感的猪。本专利技术应用涉及针对羊建立的伪狂犬病毒抗体的ELISA检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术要解决问题是建立一种检测羊PRV抗体的ELISA试剂盒，用以代替病毒中和试验等传统的血清学方法，用以实现敏感性高、特异性强、稳定性好的高通量大规模的羊体内PRV抗体水平的监测。 本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种检测羊伪狂犬病毒抗体的ELISA试剂盒，包括以下组分:包被板、阳性对照、阴性对照、酶标结合物、样品稀释液、20 X浓缩洗涤液、底物液、终止液、封口胶。 上述酶标结合物是由酶标抗体稀释液稀释2000倍的HRP标记的兔抗山羊IgG (购自北京中杉金桥生物技术有限公司)每一试剂盒装有I瓶体积为20ml的酶标结合物，4°C保存；。 上述酶标抗体稀释液为NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.Iffi2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，甘油 20ml,小牛血清 200ml, Casein 5g,鹿糖 2g, Triton X-100 10ml,硫柳萊 0.lg,加纯水定容至1L。 上述样品稀释液包括NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H20 2.9g，KH2P04 0.2g，吐温-20 5ml，甘油10ml，小牛血清100ml，硫柳汞0.lg，加纯水定容至1L。 上述包被板由伪狂犬病毒的重组gD蛋白作为包被抗原，并由封闭液封闭，所述封闭液为 NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPCM.12H20 2.9g,KH2P04 0.2g，小牛血清 100ml，蔗糖 50g,明胶lg，Casein 2.5g,硫柳萊0.lg,加纯水定容至1L。 上述阴性对照:以样品稀释液将不含PRV抗体的阴性羊血清做40倍稀释，每一试剂盒装有I只体积为Irnl的阴性对照，4°C保存；上述阳性对照:以样品稀释液将含PRV抗体的阳性羊血清做100倍稀释，每一试剂盒装有I只体积为Iml的阳性对照，4°C保存。 上述重组gD蛋白的表达和纯化包括如下步骤:1)根据GenBank公布的登录号为AY196984的PRVFa株的gD基因序列，设计引物序列如下: Pl:5’ -GGGGAATTCTACCCGTACAC-3’ P2:5， -GGGCTCGAGCCTCAGGCGGA-3，2)通过PCR扩增PRVFa株gD基因，与pMD18_T克隆载体连接； 3)双酶切重组质粒pMD18-T-gD，构建重组表达载体PET-32a-gD；4)重组质粒PET-32a-gD转化感受态细胞BL21(DE3)，诱导表达，然后纯化设备，亲和柱进行亲和纯化。 上述20 X 浓缩洗涤液为 NaCl 80g, KCl 2g，Na2HPO4.12H20 29g，KH2PO4 2g，吐温-20 5ml，加纯水定容至500ml。 上述终止液为IM H2SO4,4°C保存，所述底物液为可溶型单组分TMB底物液。 上述试剂盒还包括自封袋和使用说明书。 上述一种检测羊伪狂犬病毒抗体的ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于，主要使用方法如下:(1)在Al和A2孔中分别加入100μ I阴性对照；在A3和Α4孔中分别加入100 μ I阳性对照；(2)取100μ I经1:40稀释好的待检样品液加入相应孔中，并做好记录；37 °C孵育 Ih ；(3)将各孔的液体弃入废液桶，每孔加250μ I的洗涤液进行洗板，重复5次，每次30s ； (4)每孔加100μ I酶标结合物；37 °C孵育Ih ；(5)重复步骤(3)；(6)每孔加100μ I底物液; (7)37°C避光显色孵育1min ；(8)每孔加100μ I的终止液；立刻于450nm波长处测定各孔的吸光度值，即0D450nm 值；(9)临界值(C.0.)的计算；正常情况下，阳性对照孔0D450值彡0.4 ;阴性对照孔0D450值< 0.2 ;临界值=0.17+阴性对照孔均值；阴性对照孔0D450值大于0.2时应舍弃，如所有阴性对照孔0D450值都大于0.2时须重复实验；阴性对照孔低于0.05时以0.05计算；(10)结果判定；检测样品0D450值>临界值，判定该检测样品为阳性；检测样品0D450值< 临界值，判定该检测样品为阴性。 封口胶:购自商品化的精制不干胶纸，用以在试验中盖住反应的微孔板；本专利技术的有益效果是:本专利技术中所述的包被抗原为基因工程方法表达的重组gD蛋白， 具有很强的特异性、敏感性，能真实准确地反应羊群中PRV的抗体水平。 本专利技术中所述的封闭液(NaCl8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H20 2.9g, KH2PO40.2g,小牛血清 10ml,鹿糖 50g,明胶 lg, Casein 2.5g,硫柳萊 0.lg,加纯水至1L)，试验显示PRV阴性对照及阴性血清OD值显著降低，消除样品中非特异性IgG结合微孔板底的干扰，较好的起到了封闭微孔板底空白位点的作用，4°C放置6个月稳定不沉底不变质。 本专利技术中所述的样品稀释液与PBS的比较试验显示PRV阴性对照及阴性血清OD值显著降低，与口蹄疫、布病、羊痘等的交叉反应明显减弱，较好的起到减少非特异性结合、消除假阳性的作用，稳定性试验显示4°C放置6个月稳定不沉底不变质；用样品稀释液稀释成工作浓度的阳性对照，加速破坏性试验显示37°C烤9d OD值降低30%以内。 本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测羊伪狂犬病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括以下组分：包被板、阳性对照、阴性对照、酶标结合物、样品稀释液、20×浓缩洗涤液、底物液、终止液、封口胶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王金良，沈志强，董艳凯，董炳梅，陈金龙，魏凤，
申请(专利权)人：山东省滨州畜牧兽医研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。