本发明专利技术公开一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒及制备方法。本发明专利技术的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒中包括包被有从山羊支原体山羊肺炎亚种培养物提取的多糖为抗原的酶标板。同时本发明专利技术的试剂盒具有重复性好，检测使用方法简便的优点。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒及制备方法。本专利技术的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒中包括包被有从山羊支原体山羊肺炎亚种培养物提取的多糖为抗原的酶标板。同时本专利技术的试剂盒具有重复性好，检测使用方法简便的优点。【专利说明】用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒及 制备方法
本专利技术涉及一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒及制备 方法。
技术介绍
山羊支原体山羊肺炎亚种是山羊传染性胸膜肺炎的病原，山羊传染性胸膜肺炎是 世界动物卫生组织（0ΙΕ)所列需要上报和监控的重要疾病之一。1922年本病在我国新疆伊 犁地区发生，此后甘肃、宁夏、青海、四川、贵州等十余省市均有临床诊断报道，危害严重。目 前针对该病的血清学检测技术主要是间接血凝试验方法，参见：赵萍等，2008，甘肃农业大 学学报。众所周知，间接血凝试验方法虽然操作简单，但敏感性低，判定标准有一定误差，对 发病初期以及早期接种疫苗的动物往往检测不到抗体，导致误诊误判。
技术实现思路
本专利技术提供一种检测方法简洁明了、具有高敏感性、高特异性及重复性良好的用 于检测山羊支原体山羊肺炎亚种血清抗体的试剂盒。 本专利技术的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒中包括包被有 从山羊支原体山羊肺炎亚种培养物提取的多糖为抗原的酶标板。 为方便使用，本专利技术的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒中 还包括有： (1) 阳性对照血清； (2) 阴性对照血清； (3) 兔抗羊IgG-辣根过氧化物酶结物； (4) 25倍浓缩洗涤液； (5) 血清稀释液； (6) 由柠檬酸、Na2HP04.和邻苯二胺构成的底物溶液A ; (7) 作为底物溶液B的双氧水； (8) 终止液。 本专利技术的用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒中抗原的制备 方法是从山羊支原体山羊肺炎亚种培养物上清中提取多糖。 本专利技术所述的抗原制备方法是 (1) 将山羊支原体山羊肺炎亚种菌种按5%量接种于Thicaucourt' S培养基，37°C下经 3飞次连续扩大培养，当培养物pH值下降至6. 8~7. 0,培养基颜色变为黄色，12000 rpm离心 30 min,取上清液； (2) 用冰醋酸调节培养物上清pH值到5. 0,煮沸60 min，等冷却后用滤纸过滤去除 杂质，得到滤液；将两倍体积量的无水乙醇加入到滤液中混匀，4 °C过夜，5000rpm离心20 min，去上清，将沉淀物溶解在适量灭菌水中； (3) 加入等体积60%苯酚（V/V)，混匀，68°C水浴1 h，取出置4°C过夜后，6000 rpm离 心30min,取上清； (4) 将上清装入透析袋中，用自来水透析48 h; (5) 向透析液中加入两体积的无水乙醇，混勻，置4°C过夜后，7000rpm离心30 min, 弃上清，收集沉淀物； (6) 将沉淀物溶于适量无菌水，装入透析袋中，用灭菌水透析48 h，每4h换一次水； (7) 取出透析液，在常温下进行适宜倍数浓缩，即得到粗多糖提取物。 本专利技术制备抗原中使用的Thicaucourt' s培养基为每1000ml培养基包含：PPL0 21 g，葡萄糖lg，25% (m/v)酵母浸液100 ml，健康马血清200 ml，1%醋酸铊溶液1 ml，青 霉素200 IU/ml，0.4%酚红0.18 ml，用氢氧化钠溶液调整pH值至7. 4?7. 6。 采用本专利技术的试剂盒检测方法比现阶段广泛采用的间接血凝试验具有更好的敏 感性；而且本专利技术的试剂盒具有特异性，对健康山羊血清、丝状支原体山羊亚种阳性血清、 绵羊肺炎支原体阳性血清、溶血曼氏杆菌阳性血清、猪肺炎支原体阳性血清用本专利技术的试 剂盒进行检测，其结果均为阴性；同时本专利技术的试剂盒重复性好。 【具体实施方式】 以下结合实施例详细解说本专利专利技术。 一、抗原制备（7. 1支原体培养和培养上清收集） (1)从某发病羊场确诊患有支原体山羊肺炎亚种病的羊血清中分离得到支原体山羊肺 炎亚种的菌种。 (2)培养基制备：Thicaucourt' s培养基的配制：每1000ml培养基包含：PPL0 21 g，葡萄糖lg，25%酵母浸液100 ml，健康马血清200 ml，1%醋酸铊溶液1 ml，青霉素200 IU/ ml，0. 4%酚红0. 18 ml，1 mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7. 4~7. 6,无菌分装。 (3)培养：将山羊支原体山羊肺炎亚种菌种按5%量接种于Thicaucourt' s培养 基，37°C下经:Γ5次连续扩大培养，当培养物pH值下降至6. 8~7. 0,培养基颜色变为黄色， 12000 rpm离心30 min,取上清备用。 二、包被抗原的制备 (1)用冰醋酸调节培养物上清pH值到5. 0,煮沸60 min,等冷却后用Whatman滤纸过 滤，去除杂质，得到滤液。 (2)将两倍体积量的无水乙醇加入到滤液中混匀，4°C过夜，5000rpm离心20 min， 去上清，将沉淀物溶解在适量灭菌水中。 (3)加入等体积60%苯酚（V/V)，混匀，68°C水浴1 h，取出置4°C过夜后，6000 rpm 离心30min，取上清。 (4)将上清装入透析袋中，用自来水透析48 h。 (5)向透析液中加入两体积的无水乙醇，混匀，置4°C过夜后，7000rpm离心30 min, 弃上清，收集沉淀物。 (6)将沉淀物溶于适量无菌水，装入透析袋中，用灭菌水透析48 h，每4h换一次 水。 (7)取出透析液，在常温下进行适宜倍数浓缩，即得到粗多糖提取物。 三、抗原的浓度测定 本专利技术实施例中是用苯酚-浓硫酸法对抗原进行测定。 (1)制作葡萄糖的标准曲线：准确称取标准葡萄糖400mg于200毫升容量瓶中，力口 双蒸水至刻度。分别取 〇· 2ml、0· 3m、0· 4ml、0· 5ml、0· 6ml、0· 8ml、1. 0ml，各加水补至 1. 0ml， 分别加入6%的苯酚（V/V) 0. 5ml、浓硫酸2. 5ml，摇匀，室温放置20min后，于490nm处测定 0D值。以1. 0ml双蒸水按同样操作为空白，以横坐标为多糖含量，纵坐标为0D值，绘制标准 曲线，得到回归方程。 (2)样品含量的测定：取样品液1ml，用双蒸水进行5倍稀释后，再取1ml，分别加 入6%的苯酚（V/V) 0. 5ml、浓硫酸2. 5ml，摇勻，室温放置20min后，于490nm处测定0D值。 以回归方程计算多糖的含量。 四、酶标板的包被 将抗原用PH9.6、浓度为0.05 mol/L碳酸盐缓冲液稀释成一个单位（5 Pg/ml)，用微量 移液器将稀释好的抗原加到酶标板各孔内，每孔50 μ 1，然后将酶标板置湿盒中4°C过夜。 甩掉酶标板孔内的抗原包被液，加洗涤液PBST(含0. 05%Tween20的0.01 mol/L pH7. 4 PBS) 300 μ 1，室温下浸泡2分钟，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡。再重新加洗涤 液，按同法洗涤4次，拍本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的ELISA试剂盒，其特征在试剂盒中包括包被有从山羊支原体山羊肺炎亚种M2301株培养物提取的多糖为抗原的酶标板。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵萍，逯忠新，贺英，储岳峰，陈胜利，刘永生，王展慧，简莹娜，秦明明，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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