一种抗人肺炎支原体P30蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种抗人肺炎支原体P30蛋白抗体及应用该抗体检测人肺炎支原体的免疫层析试剂盒，抗人肺炎支原体P30蛋白抗体是识别人肺炎支原体P30蛋白142‑155位氨基酸所组成的线性抗原表位的抗体，人肺炎支原体P30蛋白在GenBank序列号是ABR09215.1；人肺炎支原体P30蛋白142‑155位的氨基酸序列为AHAEAEVEPAPQPV。本发明专利技术所提供的兔抗人肺炎支原体P30蛋白抗体具有特异性好、纯度高、效价高、制备成本低廉的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
，涉及一种抗人肺炎支原体P30蛋白抗体及应用该抗体检测人肺炎支原体的免疫层析试剂盒。
技术介绍
肺炎支原体(M.Pneumonia)是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎的病理改变以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎。主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，发病率以青少年最高。临床症状为头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状，一年四季均可发生，但多在秋冬时节。Mp感染在小儿肺炎病原的发生率高达10-30％，近年来逐渐成为小儿感染呼吸道疾病的主要病原体之一。该病极易引发咽炎、扁桃体炎等呼吸道感染，甚至可能同时继发脑膜炎、肝炎、心肌炎等多脏器损伤，严重时也可导致患儿死亡。由于Mp感染与其它病原体引起的呼吸道感染症状类似，不做病原学检查，很难将Mp与其它病原体引起的呼吸道感染相区别。Mp无细胞壁，常用的β-内酰胺类药物对其无效，故其引起的感染的治疗与其它细菌和病毒感染的治疗方案完全不同，因此建立简便、快速、可行、能早期诊断肺炎支原体感染的方法非常必要。目前Mp的检测方法主要有3类：一是分离培养法，其是证实感染的“金标准”，但由于Mp的生长周期极为缓慢，培养周期长，导致该法在临床上不能进行快速诊断；二是血清学方法，即采用酶联免疫法、胶体金免疫法、微量免疫荧光法和间接血凝试验等，检测被检者血清中Mp抗体水平，可间接提示Mp感染的存在。然而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊断，而且有时需要双份血清。另外，抗体出现的时机不易掌握，儿童、青少年与成人之间又存在Mp特异性抗体的差异，并且，Mp细胞膜上的糖脂抗原与其他微生物及机体组织存在非特异性交叉反应，故现有血清学方法的检测质量受到一定限制；三是利用分子生物学技术检测Mp DNA的存在，其中最常用的是聚合酶链式反应(PCR)，该方法快速、灵敏、特异，是目前研究Mp感染的重要手段，但由于PCR对实验设备以及操作要求较高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。因此，建立Mp特异性抗原诊断方法十分必要。目前，已公开报道的检测Mp抗原的方法主要为双抗夹心ELISA法，
间接免疫荧光法，量子点标记免疫层析法等，但这些方法均不能实行床旁检测，需要到特定的场合利用特定的仪器(如酶标仪、荧光仪等)来检测，不仅不够方便快捷而且时间较长，临床应用较为不便。因此，建立人肺炎支原体特异性抗原的快速诊断方法十分必要。由于人流感肺炎支原体P30蛋白序列上的高度保守性，使其成为了一个重要的检测标的。因此获得高特异性的抗人肺炎支原体P30蛋白抗体就是一个十分重要的工作。目前，关于抗人肺炎支原体P30蛋白抗体报道得最多的为相应的单克隆抗体及多克隆抗体。单克隆抗体最大的优点就是特异性高，但是制备方法繁琐，生产成本高，限制了其应用。多克隆抗体主要由基因工程表达的P30蛋白免疫家兔等动物制备而成。其制备方法简单，成本低，但是基因工程表达的P30蛋白为包涵体结构，不具天然蛋白结构，用其制备的抗体其具有特异性低、效价低等缺陷。因此，低成本的制备高特异性、高效价的抗人肺炎支原体P30蛋白抗体就显得十分重要。
技术实现思路
针对
技术介绍
中存在的这些技术问题，本专利技术的目的在于提供识别人肺炎支原体P30蛋白142-155位氨基酸所组成的线性抗原表位的抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒。抗人肺炎支原体P30蛋白抗体，其特征在于：所述抗人肺炎支原体P30蛋白抗体是识别人肺炎支原体P30蛋白142-155位氨基酸所组成的线性抗原表位的抗体，所述人肺炎支原体P30蛋白在GenBank序列号是ABR09215.1；所述人肺炎支原体P30蛋白142-155位的14个氨基酸序列为AHAEAEVEPAPQPV；将人肺炎支原体P30蛋白142-155位的14个氨基酸的序列命名为P30Linear；所述抗人肺炎支原体P30蛋白抗体是AbP30Linear。一种基于如前所述的抗人肺炎支原体P30蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒或基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒。作为优选，本专利技术所提供的试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒时，所述试剂盒的制备方法是：1)量子点标记抗体AbP30Linear：向微量离心管中依次加入0.4nmol羧基水溶性量子点和800nmol碳二亚胺EDC，以MES缓冲液定容为1ml，混合溶液，37℃反应5min后，再加入0.34mg
的制备得到的抗体AbP30Linear，避光反应2h，加入单端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至终浓度为1％(m/v)，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；反应后的样品用超滤管离心(截留分子量100k)，6500g离心5min，至体积200ul，将超滤后样品转移至普通EP管内，离心除团聚，得到上部清液以及下部沉淀，10000g条件下离心3min；将上部清液加到分离柱Superdex-200上纯化，待上部清液自然流入柱体中，然后用PBS冲洗，用紫外光照射柱体观察样品的位置，待样品开始从下部流出时开始收集，收集1ml后停止收集；将纯化后的样品用超滤管(截留分子量100k)以6500g离心浓缩至200ul后转移至普通EP管内离心除团聚，对普通EP管进行离心的条件是10000g，3min；获取上清后以磷酸盐保存液稀释200倍，4℃保存备用；至此制得含有量子点标记抗体AbP30Linear的溶液；所述MES缓冲液中各组分含量分别是：10.66g/L MES以及0.74g/L EDTA，所述MES缓冲液的pH 7.4；所述磷酸盐保存液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0.2g氯化钠、1g牛血清白蛋白BSA以及0.1gNaN3，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；2)制备结合垫将聚酯纤维膜浸入步骤1)所得到的含有量子点标记抗体AbP30Linear的溶液中1h，取出，25℃干燥后裁成后规格为4cm×0.6cm/条后，4℃密封保存备用，至此制得结合垫；3)制备样品垫取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成规格为4cm×2.5cm/条后，即制得样品垫，25℃密封保存；所述样品垫处理液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0.2g氯化钠、2g牛血清白蛋白BSA、1ml吐温-20、2g蔗糖以及0.5g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；4)制备检测层以申请号为201410405275.3专利技术名称为“人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用”的说明书中第【0134】段至【0158】段所公开的
内容制备兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG。将硝酸纤维素膜剪成4cm×4cm大小；将按上述方法制备得到的兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG和羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0mg/mL及1.0mg/mL；将稀释好的兔抗重组P1-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗人肺炎支原体P30蛋白抗体，其特征在于：所述抗人肺炎支原体P30蛋白抗体是识别人肺炎支原体P30蛋白142‑155位氨基酸所组成的线性抗原表位的抗体，所述人肺炎支原体P30蛋白在GenBank序列号是ABR09215.1；所述人肺炎支原体P30蛋白142‑155位的14个氨基酸序列为AHAEAEVEPAPQPV ；将人肺炎支原体P30蛋白142‑155位的14个氨基酸的序列命名为P30Linear；所述抗人肺炎支原体P30蛋白抗体是AbP30Linear。

【技术特征摘要】
1.一种抗人肺炎支原体P30蛋白抗体，其特征在于：所述抗人肺炎支原体P30蛋白抗体是识别人肺炎支原体P30蛋白142-155位氨基酸所组成的线性抗原表位的抗体，所述人肺炎支原体P30蛋白在GenBank序列号是ABR09215.1；所述人肺炎支原体P30蛋白142-155位的14个氨基酸序列为AHAEAEVEPAPQPV ；将人肺炎支原体P30蛋白142-155位的14个氨基酸的序列命名为P30Linear；所述抗人肺炎支原体P30蛋白抗体是AbP30Linear。2.一种基于如权利要求1所述的抗人肺炎支原体P30蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒或基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒。3.根据权利要求2所述的抗人肺炎支原体P30蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒时，所述试剂盒的制备方法是：1）量子点标记抗体AbP30Linear：向微量离心管中依次加入0.4nmol羧基水溶性量子点和800nmol碳二亚胺EDC，以MES缓冲液定容为1 ml，混合溶液，37℃反应5 min后，再加入0.34 mg的制备得到的抗体AbP30Linear，避光反应2 h，加入单端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至终浓度为1%m/v，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1 h；反应后的样品用超滤管离心，6500g离心5min，至体积200ul，将超滤后样品转移至普通EP管内，离心除团聚，得到上部清液以及下部沉淀，10000g条件下离心3min；将上部清液加到分离柱Superdex-200上纯化，待上部清液自然流入柱体中，然后用PBS冲洗，用紫外光照射柱体观察样品的位置，待样品开始从下部流出时开始收集，收集1 ml后停止收集；将纯化后的样品用超滤管以6500g离心浓缩至200ul后转移至普通EP管内离心除团聚，对普通EP管进行离心的条件是10000g，3min；获取上清后以磷酸盐保存液稀释200倍，4℃保存备用；至此制得含有量子点标记抗体AbP30Linear的溶液；所述MES缓冲液中各组分含量分别是：10.66 g/L MES以及0.74 g/L EDTA，所述MES缓冲液的pH 7.4；所述磷酸盐保存液的制备方式是称取0.29 g磷酸氢二钠、0.0295 g磷酸二氢钠、0.2 g氯化钠、1 g牛血清白蛋白BSA以及0.1 gNaN3，溶解于90 ml的去离子水中，用1 mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；2）制备结合垫将聚酯纤维膜浸入步骤1）所得到的含有量子点标记抗体AbP30Linear的溶液中1 h，取出，25℃干燥后裁成后规格为4cm×0.6cm/条后，4℃密封保存备用，至此制得结合垫；3）制备样品垫取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3 h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成规格为4cm×2.5cm/条后，即制得样品垫，25℃密封保存；所述样品垫处理液的制备方式是称取0.29 g磷酸氢二钠、0.0295 g磷酸二氢钠、0.2 g氯化钠、2 g牛血清白蛋白BSA、1 ml吐温-20、2 g蔗糖以及0.5 g 聚乙烯吡咯烷酮PVP-10，溶解于90 ml的去离子水中，用1 mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；4）制备检测层4.1）制备兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG；4.2）将硝酸纤维素膜剪成4cm×4cm大小；将步骤4.1）制备得到的兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG和羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0 mg/mL及1.0 mg/mL；将稀释好的兔抗重组P1-His融合蛋白多克隆抗体IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0 μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0 μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，质控线与检测线间距为0.7 cm；将喷好的硝酸纤维素膜37℃干燥2 h，剪裁成4cm×4cm的规格，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；所述磷酸盐缓冲液的制备方式是：称取0.29 g磷酸氢二钠、0.0295 g磷酸二氢钠以及0.2 g氯化钠，溶解于90 ml的去离子水中，用1 mol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；5）组装检测卡5.1）将底板裁剪成4cm×7.3cm大小，备用；5.2）将吸水滤纸裁剪成4cm×3cm大小，作为吸水垫，备用；5.3）将步骤5.1）制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉，将步骤4）所述的检测层即带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜粘贴到底板上，并抹平膜面；5.4）将步骤5.2）准备好的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层右末端有0.2 cm的重叠，吸水垫的右边缘则与底板的右边缘对齐粘好并抹平；再将步骤2）所述的结合垫按0.3 cm重叠于检测层的左边缘处，0...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡征，董俊，杨波，
申请(专利权)人：湖北工业大学，湖北华龙生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42