一种人肺炎支原体培养基及其诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种人肺炎支原体培养基及其诊断试剂盒，人肺炎支原体培养基包括TSB培养基与添加剂，所述的添加剂包括牛血清、DMEM、禽蛋黄提取物、丙酮酸钠以及谷氨酰胺，所述的DMEM含量为人肺炎支原体培养基总含量的5-15％(体积分数)，以人肺炎支原体培养基总体积计，所述的禽蛋黄提取物含量为10-100ml/L，所述的丙酮酸钠含量为0.2-1.0g/L，所述的谷氨酰胺含量为0.3-1.0g/L。与现有技术相比，本发明专利技术的培养基在大量实践基础上进行实用创新设计，符合需要，确保临床Mp感染诊断的特异性、可靠性，同时体现使用方便、快速安全、环保及资源节约的要求。

【技术实现步骤摘要】
一种人肺炎支原体培养基及其诊断试剂盒
本专利技术涉及一种支原体培养基及其诊断试剂盒，尤其是涉及一种人肺炎支原体培养基及其诊断试剂盒。
技术介绍
被发现近百年的支原体是一类无细胞壁的原核细胞型微生物，介于病毒与细菌之间。目前已分离到150多种。与人类疾病有关的主要是肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,Mp)、解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum,简称Uu)及人型支原体(Mycoplasmahominis,简称Mh)等。Mp早就证明是非典型性肺炎的重要病原菌，诊断难度大，易引起并发感染，死亡率较高。2003年非典流行后，社区性呼吸道感染流行时，更加引起医疗界的关注。Mp可进入血液，并可在呼吸系统以外的部位增殖，引起肺外并发症。并发症多出现于呼吸道症状后3～30d，常累及心血管系统、血液系统、中枢神经系统、皮肤及肝肾器官。随着对病原的不断认识和临床资料的不断积累，肺外感染的表现也越来越引起临床医生的关注和重视。Mp的基因组小，仅是大肠杆菌的1/5～1/4，细胞小(小于100nm)且多形，有液体运动性；菌体集落小于1-2mm，肉眼难见，通常借助40-100倍显微镜检查计数。Mp生长繁殖的生理生化条件相对简单而自然地依附宿主组织细胞并有胞内生存的特点，难于人工培养且生长缓慢；与其他支原体的种间差异大，各有特点可用于分离、鉴别。此等造成临床诊断、治疗的困难，同时是研发技术的诀窍伏点。国外Mp的培养分离有商品化的Difco、Oxoid等公司干燥基础基，法国生物梅里埃的成品培养基。液体培养常用试管、青霉素安培瓶，固体培养惯用圆形培养皿等，还有双相培养的，但是，均对习湿需CO2的支原体的培养都不如人意。商品液体培养基培养于37℃-38℃，4-7天，有的要10天后观察出报告。都以变色判断结果，有的阳性率低，有的出现假阳性。我国对支原体基础及医院实验诊断的研究起步晚，多模仿国外方法，存在着临床培养阳性率低、易污染杂菌、出现假阳性等诸多问题，不能满足临床诊断治疗的需求；而且国内各实验室用于支原体的分离培养基，多数进口，价格昂贵；有的自制，质量不稳定，卫生管理部门已立法管理，促进研发创新产品。Mp常用培养基为PPLO培养基，很多公司都有出售，但血清(常用马血清或猪血清)和抗生素自己添加，在液体培养基中通常要加入酚红做指示剂，当培养基由红色变为黄色时，即可判定Mp的生长。实际上，支原体的分离生长难，盲传几次，液体培养基变黄后，在固体培养基上出现典型菌落，才获得纯分离的菌株。微生物学发展中，Mp曾称为“难养菌”，不但对营养要求严格，而且对培养环境中的湿度、温度、氧分压及基质pH等条件也很特殊。Mp生长繁殖的最适pH是7.4-7.6，60％～80％湿度环境。传统的难养菌的分离培养及鉴定的方法，复杂、繁琐、易于污染、成本昂贵。本专利技术是从大量实践中总结经验而设计的，试制品能够满足临床诊断的特异性、可靠性要求，同时达到快速、安全、环保、资源节约。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种人肺炎支原体培养基及其诊断试剂盒。本专利技术创新设计新的Mp培养基配方，适用于Mp感染引起非典型性肺炎病原体的分离培养及鉴别，而获取病原菌的临床诊断信息。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种人肺炎支原体培养基，包括TSB培养基与添加剂，所述的添加剂包括牛血清、DMEM、禽蛋黄提取物、丙酮酸钠以及谷氨酰胺，所述的DMEM含量为人肺炎支原体培养基总含量的5-15％(体积分数)，以人肺炎支原体培养基总体积计，所述的牛血清的含量为100ml/L，所述的禽蛋黄提取物含量为10-100ml/L，所述的丙酮酸钠含量为0.2-1.0g/L，所述的谷氨酰胺含量为0.3-1.0g/L。作为优选，每1000ml人肺炎支原体培养基还含有以下抑菌剂：氨苄青霉素1百万单位，纳他霉素50mg。每1000mlTSB培养基含有以下成分：所述的禽蛋黄提取物中含有维生素A及有机硒，所述的维生素A含量为2～10u/ml，所述的有机硒含量为0.2～2.0ppm。作为优选，所述的禽蛋黄提取物还含有微量的不饱和脂肪酸类与磷脂类物质，以及10-25v/v％的乙醇。所述的禽蛋黄提取物制备方法如下：(1)取新鲜富硒鸡蛋置入70v/v％乙醇溶液中浸泡30分钟；(2)在超净工作台上无菌操作取蛋黄，将蛋黄置于无菌烧瓶中；(3)向含有蛋黄的无菌烧瓶中以1：2重量比例，加入90v/v％乙醇，充分搅拌、混匀，封闭瓶口后置于4℃～8℃下，保存20-24h；(4)用1NNaoH调节步骤(3)处理后溶液的pH至7.0～8.0，并6000RPM离心，取上清液，将上清液以0.45μm滤膜无菌过滤后，滤液即为禽蛋黄提取物，将滤液无菌分装后，备用。所述的人肺炎支原体培养基通过稀酸稀碱调节酸碱度，使培养基灭菌后pH为7.4-7.6。若使用固体培养基则每升培养基中加入琼脂10-15g。使用上述培养基时，再加入酚红指示剂、纳他霉素和氨苄青霉素，特别注意，在加氨苄青霉素时，要求先用蒸馏水(纯水)把小瓶内的粉剂氨苄青霉素充分溶解后再加到培养液中，同时要即用即配。一种包括所述的人肺炎支原体培养基的诊断试剂盒。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：(1)本专利技术的培养基能满足Mp选择性培养，以TSB配方为基础，还添加细胞培养基DMEM、蛋黄提取物等，有利于Mp的生长，在培养48-72h后，于固体培养基上可见菌落。培养基中若不加琼脂，即液体培养及药敏鉴定，40-44h可观察生长与否、报告结果。(2)本专利技术的培养基选择性好：对怀疑Mp感染的患者标本(如痰、体液、组织等)检测，可以获得Mp病原菌的典型菌落，提供临床诊断信息；其他支原体(如Mh、Uu等)及常见细菌均不生长。(3)本专利技术的培养基中添加有DMEM(dulbecco'smodifiedeaglemedium的缩写)，其特点是：氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；维生素含量为依格尔培养基的4倍；含有糖酵解途径中的重要物质—丙酮酸；含有微量元素金属离子。因此其适合于培养包括肺及肺癌细胞等多种细胞株。(4)在原有支原体培养基中加入5-15％的DMEM，效果明显，突破支原体难培养的瓶颈。Mp生理生化特殊，生长繁殖加快，而且易与Uu/Mh鉴别。(5)本专利技术的培养基中添加有禽蛋黄提取物，禽蛋黄提取物含有大量维生素A，维生素A系化合物是一种生物的有效的捕获活性氧的抗氧化剂，能防止脂质过氧化，参与糖蛋白的合成，对于上皮细胞的正常形成、发育与维持十分重要，也有利于支原体细胞生长繁殖及细胞膜糖蛋白等形成和稳定。故适当添加维生素A后，发现Mp生长繁殖加快了，使用本专利技术的支原体培养基，48-72h后，可40-100倍镜检到典型Mp菌落，也可见培养液变黄。对Mp分离培养、鉴别及药敏测定等检测、诊断报告提供方便。而一般市售同类产品，要4-7天甚至10天后，才能做出相同报告，因此使用本专利技术的培养基与试剂盒，能够提高时效性。(6)本专利技术的培养基中添加有丙酮酸钠以及谷氨酰胺，其中，丙酮酸钠是重要的生理、能量代谢的中间体，谷氨酰胺能够促进支原体的生长，因此，本专利技术的培养基能够有利于支原体生长繁殖，适用于支原体的生理生化特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人肺炎支原体培养基，其特征在于，包括TSB培养基与添加剂，所述的添加剂包括牛血清、DMEM、禽蛋黄提取物、丙酮酸钠以及谷氨酰胺，所述的DMEM含量为人肺炎支原体培养基总含量的5‑15％(体积分数)，以人肺炎支原体培养基总体积计，所述的牛血清的含量为100ml/L，所述的禽蛋黄提取物含量为10‑100ml/L，所述的丙酮酸钠含量为0.2‑1.0g/L，所述的谷氨酰胺含量为0.3‑1.0g/L。

【技术特征摘要】
1.一种人肺炎支原体培养基，其特征在于，包括TSB培养基与添加剂，所述的添加剂包括牛血清、DMEM、禽蛋黄提取物、丙酮酸钠以及谷氨酰胺，所述的DMEM含量为人肺炎支原体培养基总含量的5-15％(体积分数)，以人肺炎支原体培养基总体积计，所述的牛血清的含量为100ml/L，所述的禽蛋黄提取物含量为10-100ml/L，所述的丙酮酸钠含量为0.2-1.0g/L，所述的谷氨酰胺含量为0.3-1.0g/L；所述的禽蛋黄提取物中含有维生素A及有机硒，所述的维生素A含量为2～10u/ml，所述的有机硒含量为0.2～2.0ppm；所述的人肺炎支原体培养基通过稀酸稀碱调节酸碱度，使培养基灭菌后pH为7.4-7.6。2.根据权利要求1所述的一种人肺炎支原体培养基，其特征在于，每1000ml人肺炎支原体培养基还含有以下抑菌剂：氨苄青霉素1百万单位，纳他霉素50mg。3.根据权利要求1所述的一种人肺炎支原体培...

【专利技术属性】
技术研发人员：文凤岐，武济民，孙亚洲，肖家祁，
申请(专利权)人：众爱生河北生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13