一种极长链霉菌株SL01及其微生物菌剂和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种极长链霉菌株SL01(Streptomyces longissimus SL01)及由该菌株制备的微生物菌剂：由该SL01菌株制备得到的发酵液及发酵滤液。本发明专利技术还公开了两种微生物菌剂在防治苹果树腐烂病中的应用。采用不同处理方法涂抹菌株SL01发酵液及发酵滤液发现，离体枝条和果实的防效均达到90％，与药剂对照甲基硫菌灵达到同一水平；2012年大田试验中，刮病斑后涂抹SL01菌剂防治效果100％，划线后涂抹防效为58％；2013年大田试验中，刮病斑后涂抹SL01菌剂防治效果97.8％，超过甲基硫菌灵药剂对照的防效(84.6％)，划线后涂抹防效为64.4％，均可有效降低为防治苹果树腐烂病而大量施用化学农药所造成的对生态环境的破坏，具有很好的生态和社会效益，开发应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种极长链霉菌株SL01及其微生物菌剂和应用
本专利技术属于植物保护
，涉及一种极长链霉菌株、由该极长链霉菌制备的微生物菌剂以及其在防治苹果树腐烂病中的应用。
技术介绍
近年来，中国苹果产业发展势头迅猛，果树栽植面积和产量连续较快增长，截至2012年相关统计结果显示，我国果树种植面积达到接近4000万亩，我国已进入由世界苹果生产大国向苹果产业强国转变的重要阶段。但是，伴随着苹果种植面积持续扩张及管理果园方法不当，苹果树腐烂病病情逐年加重。2008年我国苹果主要产区的果园腐烂病发生情况调查中，苹果树腐烂病总体发病率达50％以上，并伴随因高毒农药滥用造成生态环境恶化等问题，苹果树腐烂病已严重影响了苹果产业的快速发展。苹果树腐烂病(Valsacankerofapple)，或称烂皮病、串皮湿和臭皮病，在我国苹果树种植地区发生范围广、造成危害严重、难以有效防治，果农们称以之为“果树癌症”。该病发生较轻时，主干或侧枝上树皮腐烂削弱树势，造成果实减产和果品质量下降；病情严重时，树体病疤累累、果树整株枯死甚至毁园，果实绝产，严重威胁苹果产业的可持续发展并给农民造成重大经济损失。目前，对于苹果树腐烂病等病害的防控主要依靠化学药剂，而化学农药的长期大量使用不仅会严重污染环境，造成对非靶标生物的有害影响，使果园生态环境恶化，同时也会增加腐烂病菌的突变几率，导致抗、耐药性菌株的大量增加。因此，寻找新的、安全有效的措施来防治苹果树腐烂病显得尤为迫切和重要。针对上述问题，为了减少对生态环境的破坏，尽量避免因防治苹果树腐烂病而大量施用有毒化学农药，利用微生物制剂来控制植物病害的生物防治手段越来越受到人们的青睐，经检索，申请者在现有的专利和非专利文献中没有检索到极长链霉菌菌株SL01用于苹果树腐烂病生物防治的相关文献报道和专利。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种针对由苹果树腐烂菌(ValsamaliMiyabeetYamada)引起的苹果树腐烂病具有显著生物防治效果的极长链霉菌菌株SL01(StreptomyceslongissimusSL01)和由该菌株发酵制备成的微生物菌剂，用来防治苹果树腐烂病。以减少因大量使用有毒化学农药对生态环境造成的破坏，以实现我国苹果产业向着安全、高效、可持续的方向发展。本专利技术的第二个目的是提供由极长链霉菌菌株SL01制备的微生物菌剂，并优化了发酵条件。本专利技术的第三个目的是提供由极长链霉菌菌株SL01制备的微生物菌剂在防治苹果树腐烂病中的应用。本专利技术通过以下技术方案实现：本专利技术从土壤中分离筛选获得一种能够用于用于防治苹果树腐烂病的菌株SL01，经形态学、生理生化特性及16SrDNA序列分析鉴定为极长链霉菌(Streptomyceslongissimus)。该菌株SL01已于2014年8月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中CGMCC，菌种保藏号为CGMCCNo.9543。在上述基础上，申请人利用液体发酵的方法制备了一种微生物菌剂，实际应用显示其对苹果树腐烂病具有防治作用。该微生物菌剂的制备步骤如下：1)活化菌株：将保存的极长链霉菌菌株SL01划线转接到高氏一号培养基或PDA培养基中，置于培养箱28～30℃恒温培养4～6天；2)制备种子液：挑取一个单菌落接种到PDB液体培养基中，25-32℃下振荡培养36-48h，振荡频率100-200r/min；3)制备发酵液：按体积比以1％-3％的接种量将步骤2)中制备的菌株SL01种子液接种于高氏培养液中，装料量为50-100mL/250mL，培养基初始pH值为6-9、发酵温度为25-32℃、振荡频率为150-200r/min、发酵时间为6-9天制得SL01发酵液；4)制备发酵液滤液：将步骤3)制备得到的SL01发酵液在3000r/min下离心10-20min，取上清，通过Φ＝0.22μm的微孔滤膜过滤得到发酵滤液原液，用无菌水将该发酵滤液原液稀释至20-100倍制得SL01发酵滤液；所述高氏培养液以高氏一号培养液为基础培养液，其中，碳源选用等质量的玉米粉、小米粉、大米粉中任一种替代可溶性淀粉，氮源选用等质量的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中任一种替代KNO3，无机盐选用占所述高氏培养液重量比为0.1％的CaCl2或0.1％的MgSO4或0.01％的FeSO4中的任一种。优选的，本专利技术提供的菌株SL01摇瓶发酵最佳基质配方为小米2.0％，酵母粉1.0％，MgSO40.15％，其余为无菌水。在28℃、初始pH＝7，接种量2％，装液量50mL/250mL，转速180r/min，发酵培养7天得到的发酵液抑菌活性最强。优选的，用无菌水将发酵滤液原液稀释至100倍得到的发酵滤液对腐烂菌菌丝抑菌效果最好。最后，本专利技术公开了上述微生物菌剂在防治苹果树腐烂病中的应用。在使用时，通过刮除果树病斑后涂抹所述微生物菌剂。根据果树的实际情况，可以适当选择含量的菌剂，优选菌株SL01：3.0×103cfu/g-9×103cfu/g。申请人利用上述微生物菌剂进行了离体枝条、果实和大田生物防治试验，均达到了良好的效果。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术提供的极长链霉菌菌株SL01对苹果树腐烂病有显著的防治效果，实施例的研究表明，通过发酵条件优化的菌株SL01的抑菌活性显著提升，采用不同处理方法涂抹菌株SL01发酵液及发酵滤液发现，离体枝条和果实的防效均达到90％，与药剂对照甲基硫菌灵达到同一水平；大田试验中，菌剂SL01对腐烂病的预防和治疗均有一定防治效果，其中，涂干预防效果为48％，刮病斑后涂抹SL01菌剂防治效果100％，划线后涂抹防效为58％。2.本专利技术所提供的极长链霉菌菌株SL01(StreptomyceslongissimusSL01)防治苹果树腐烂病效果稳定，对环境友好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。附图说明：图1菌株SL01菌丝形态观察图(A：40×显微镜图、B：扫描电镜图)图2菌株SL01系统发育树图3被菌株SL01抑制的腐烂菌菌丝形态观察图4菌株SL01发酵滤液对腐烂菌孢子萌发的抑制影响(A：20h对照组分生孢子吸涨情况；B：20h发酵滤液处理组分生孢子吸涨情况；C：36h对照组分生孢子萌发情况；D：36h发酵滤液处理组分生孢子萌发情况)图5菌株SL01发酵滤液发酵滤液对苹果树腐烂病菌菌丝生长的影响(A：CK、B：SL01发酵滤液稀释50倍)图6菌株SL01不同处理方式对苹果果实腐烂病病斑扩展抑制作用(A：对照组，B：SL01发酵液处理，C：SL01发酵滤液处理)图7菌剂SL01对苹果树腐烂病病疤重犯的防治效果(A：涂抹菌剂SL01，B：黑色塑料薄膜包裹，C：试验结果)图8甲基硫菌灵对苹果树腐烂病病疤重犯的防治效果(A：刮除病斑，B：涂抹甲基硫菌灵，C：试验结果)本专利技术菌株保藏信息：极长链霉菌菌株SL01(StreptomyceslongissimusSL01)已于2014年8月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCCNo.9543。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。实施例1：极长链霉菌菌株SL01的制备：菌株SL01本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种极长链霉菌(Streptomyces longissimus)菌株SL01，其特征在于，所述菌株SL01保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.9543，保藏日期为2014年8月25日。

【技术特征摘要】
1.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为由极长链霉菌(Streptomyceslongissimus)菌株SL01经菌株活化、种子液培养和发酵培养制得的菌株SL01发酵液以及由该发酵液经过滤稀释制备得到的发酵滤液；所述菌株SL01保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.9543，保藏日期为2014年8月25日；所述微生物菌剂为菌株SL01发酵液和发酵滤液，其制备步骤如下：1)活化菌株：将保存的极长链霉菌菌株SL01划线转接到高氏一号培养基或PDA培养基中，置于培养箱28～30℃恒温培养4～6天；2)制备种子液：挑取一个单菌落接种到PDB液体培养基中，25-32℃下振荡培养36-48h，振荡频率150-200r/min；3)制备发酵液：按体积比以1％-3％的接种量将步骤2)中制备的菌株SL01种子液接种于高氏培养液中，装料量为50-100mL/250mL，培养基初始pH值为6-9、发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：王阳，宗兆锋，戴鹏博，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61