本发明专利技术公开了一种肺炎支原体的LAMP试剂盒及其专用引物。用于检测肺炎支原体的LAMP引物，是根据肺炎支原体P1基因(GenBank号：CP002077.1)的特异性保守靶序列设计的，所述LAMP引物由六条引物组成，包括外引物MP-16F3和MP-16B3、内引物MP-16FIP和MP-16BIP、以及环引物MP-16LF和MP-16LB的组合。利用本发明专利技术可在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地定性检出纯菌、痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等样品中的肺炎支原体，无需复杂仪器，为肺炎支原体的检测提供了新的技术平台。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
中细菌的分子生物学检测，特别是涉及一种肺炎支原体 的LAMP试剂盒及其专用引物与其在检测肺炎支原体中的应用。
技术介绍
肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae，Mp)是呼吸道感染最常见的致病菌之一。我 国流行病学调查显示Mp已成为我国成人社区获得性肺炎的首要致病菌。Mp感染不但可引 起呼吸道疾病，还可引起全身多器官病变，如脑炎、心肌炎、肝炎、肾炎、免疫溶血性贫血等， 而且近些年来Mp引起的危重病例不断增多。由于Mp缺乏细胞壁，对常用抗生素如β-内 酰胺类等无效。因此，及时明确Mp感染对抗生素的合理选择和感染的及时控制具有重要意 义。 环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是 由Notomi(NotomiT，etal.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.Nucleic AcidsRes2000 ;28(12) :63.)专利技术的一种新型基因扩增技术。具体方法是针对靶基因 (DNA或者cDNA)的6个区域，设计4-6种特异引物，利用链置换DNA聚合酶，在等温条件下 可以高效、快速、高特异地扩增靶序列，结果直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判 断。LAMP技术具有快速高效、特异性强、灵敏度高、操作简单、检测直观和设备要求低等特 点。 自2000年专利技术以来，LAMP技术已被迅速用于病原微生物检测、遗传病诊 断、食品安全等领域的分子生物学检测领域。近年来，国外已将该技术广泛应用于病 原体检测。MasakiImai等人（ImaiM,NinomiyaA,MinekawaHRapiddiagnosis ofH5Nlavianinfluenzavirusinfectionbynewlydevelopedinfluenza H5hemagglutiningene-specificloop-mediatedisothermalamplificationmethod. VirolMethods. 2007May;141 (2) :173-80.)利用LAMP建立了 禽流感病毒的实验室 确诊体系。NobuyukiHayashi等人（HayashiN，AraiR，TadaS，TaguchiH，0gawaY FoodMicrobiol. 20070ct-Dec；24 (7-8):778-85Detectionandidentificationof Brettanomyces/Dekkerasp.yeastswithaloop-mediatedisothermalamplification method.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测 体系。基于LAMP技术建立的LAMP检测方法可以检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出 血性败血病（VHS)、巨细胞病毒（CMV)、埃博拉病毒（EB0V)、慢性伯基特淋巴瘤病毒（EBV)、 虹彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒（HHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病 毒等。目前，国内未见有用于检测肺炎支原体的LAMP试剂盒及其专用引物。
技术实现思路
本专利技术提供了用于对肺炎支原体进行LAMP检测的引物，以实现肺炎支原体的批 量检测，提高检测的特异性和灵敏度。 本专利技术所提供的用于检测肺炎支原体的LAMP引物，是根据肺炎支原体P1基因 (GenBank号：CP002077. 1)的特异性保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、痰液、肺泡灌 洗液、咽拭子等样品中的肺炎支原体，所述LAMP引物由六条引物组成，包括外引物MP-16F3 和MP-16B3、内引物MP-16FIP和MP-16BIP、以及环引物MP-16LF和MP-16LB的组合；所述肺 炎支原体肺炎支原体P1基因的特异性保守靶序列如序列表中SEQIDN0 :1所示。 具体来讲，所述用于对肺炎支原体进行LAMP检测的六条引物的核苷酸序列如序 列表中SEQIDN0:2(MP-16F3)、SEQIDN0:3(MP-16B3)、SEQIDN0:4(MP-16FIP)、SEQID NO:5(MP-16BIP)、SEQIDNO:6(MP-16LF)和SEQIDNO:7(MP-16LB)所示。 所述的LAMP引物，为MP-16FIP和MP-16BIP、MP-16LF和MP-16LB、以及MP-16F3 和 MP-16B3,按摩尔比40:20:5的组合物。 本专利技术的第二个目的是提供一种用于对肺炎支原体进行LAMP检测的试剂盒。 本专利技术所提供的试剂盒，包括上述用于对肺炎支原体进行LAMP检测的引物。 具体来讲，所述试剂盒包括以下用于25yL反应体系（不含模板）的试剂：RM(各 物质含量为：20mMTris，HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH4)2S04,0.1%Tween20,0·8Μ甜 菜喊（betaine)，8mMMgS04，1.4mMdNTPs) 12.5μL，8UBstDNApolymerase1μL，引物加 入量分别为：①50mM引物MP-16FIP0. 8yL，使终浓度为40pmol;②50mM引物MP-16BIP 〇· 8μL，使终浓度为40pmol;③50mM引物MP-16LF(λ4μL，使终浓度为20pmol;④50mM弓丨 物MP-16LB0· 4μL，使终浓度为 20pmol;⑤ 50mM引物MP-16F30. 1μL，使终浓度为 5pmol; ⑥50mM引物MP-16B30. 1μL，使终浓度为5pmol〇 为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为肺炎 支原体标准株基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系，如双蒸水。 上述LAMP引物或试剂盒在肺炎支原体LAMP检测中的应用也属于本专利技术的保护范 围。 本专利技术的第三个目的是提供一种肺炎支原体的LAMP试剂盒的使用方法。 该方法可包括以下步骤： 1)以待测样品基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增，LAMP反应 体系为：待测样品基因组DNA2yL，RM(各物质含量为：20mMTris.HCl(pH8. 8)，10mMKC1， 10mM(NH4)2S04,0. 1%Tween20,0· 8M甜菜碱（betaine)，8mMMgS04,1. 4mMdNTPs) 12. 5yL， 8UBstDNApolymerase1μL，ddH20 6.9μL，引物加入量为：① 50mM引物MP-16FIP 〇· 8μL，使终浓度为40pmol;②50mM引物MP-16BIP0· 8μL，使终浓度为40pmol;③50mM 引物MP-16LF0. 4yL，使终浓度为20pmol;④50mM引物MP-16LB0. 4yL，使终浓度为 20pmol;⑤ 50mM引物MP-16F30. 1μL，使终浓度为 5pmol;⑥ 50mM引物MP-16B30. 1μL，使 终浓度为5pmol;LAMP扩增条件为：置60-65°C恒温45min; 2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜 色本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测肺炎支原体的LAMP引物，是根据肺炎支原体P1基因(GenBank号：CP002077.1)的特异性保守靶序列设计的，所述LAMP引物由六条引物组成，包括外引物MP‑16F3和MP‑16B3、内引物MP‑16FIP和MP‑16BIP、以及环引物MP‑16LF和MP‑16LB的组合；所述肺炎支原体肺炎支原体P1基因的特异性保守靶序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：袁静，柏长青，苑鑫，刘威，牛文凯，崔茜，李璞媛，胡璇，李环，冯羽中，郑敬，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制所，中国人民解放军第三〇七医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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