一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法，根据所检测绵羊肺炎支原体的基因序列设计LAMP引物；确立LAMP可视化方法的反应体系，并对LAMP反应条件进行优化；采集涂擦绵羊鼻腔分泌物，制取DNA模板溶液，用最优反应体系和反应条件进行检测。本发明专利技术针对现有方法检测绵羊肺炎支原体需要专业仪器和实验室等缺点，限制了这些诊断方法在临床上的推广使用，建立可视化LAMP快速检测方法来检测MO，具有很高的特异性和敏感性，为绵羊MO感染的临床诊断提供了一个快速、简便、准确的检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种采用可视化方式进行快速检测绵羊肺炎支原体的方法。
技术介绍
绵羊支原体肺炎又被称为绵羊传染性胸膜肺炎是由绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae，MO)引起绵羊和山羊患间质性、非典型性肺炎、化脓性肺炎。自从Mackay等1963年在绵羊上首次报道以来，绵羊支原体肺炎已在世界范围内广泛流行。MO不仅感染绵羊和山羊，同时也会造成其他反刍动物(如大角羊)的感染。近年来，在我国新疆、甘肃、内蒙古、青海、陕西、宁夏、辽宁、江苏、四川、云南等多个养羊业发达的省区均有绵羊支原体肺炎的发生和流行的报道，该病严重影响着养羊业的健康发展，危害日趋加重，给我国养羊业造成巨大的经济损失。MO属于柔膜体纲，支原体目，支原体科，支原体属的一种。MO是一种缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过滤菌器的最小原核细胞型微生物。由于其基因组较小，生物合成及代谢能力有限，细胞需要的很多营养物质需要从外界摄取，因此对该病原的分离培养条件要求较高。目前有关MO的诊断方法主要集中在病原的分离鉴定、血清学检测、分子生物学检测等方面。然而，由于MO的培养比较困难并且生长速度缓慢，通过细菌学方法从病料中分离比较困难。目前，常用的血清学检测主要包括：补体结合试验(CFT)、生长或代谢抑制试验、间接血细胞凝集试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和斑点免疫渗滤试验等。CFT采用的是糖脂抗原，与动物组织可能出现交叉反应，给鉴别诊断带来困难，且操作繁琐在临床诊断中很少应用；生长或代谢抑制试验虽然特异性强、敏感性高、适用于制备支原体抗血清时进行效价测定以及支原体的血清学分析，但该方法不能区分IgM和IgG的抗体类型。IHA可检测MO抗体，但敏感性和特异性均不高。间接ELISA的特异性、敏感性、稳定性和重复性较高，但只能检测MO抗体，不能直接检测病原。PCR方法敏感、快速但依赖于昂贵复杂的精密仪器，难以在条件较差的基层推广普及使用。除此之外，上述检测方式普遍需要专业仪器和实验室，限制了这些诊断方法在临床上的推广使用。因此，本领域迫切需要研发可以推广应用的具有较高敏感性和特异性的检测绵羊肺炎支原体方法。
技术实现思路
本专利技术主要目的是提供一种釆用环介导等温扩增(LAMP)技术建立的MO感染的可视化快速检测方法。本专利技术所述的快速检测绵羊肺炎支原体的方法，是通过以下过程实现的：A、根据所检测绵羊肺炎支原体的基因序列设计LAMP引物；B、确立LAMP可视化方法的反应体系，并对LAMP反应条件进行优化；C、采集涂擦绵羊鼻腔分泌物，将采集到的绵羊鼻腔分泌物，制取DNA模板溶液，用步骤B所得反应体系和反应条件进行检测。步骤A所设计的LAMP引物包括一对内引物与一对外引物，扩增目的基因片段长度为188bp。上述LAMP引物的序列分别为：内引物：FIP——CCTACCAACTAACTAAAAAATGGGGGTGCBIP——GATTGAGATACGGCCCGTAGGAGTCTGG外引物：F3——AAGGAGCCTTTAAAGCTCB3——GCAGCAGTAAGGAATAT上述步骤B确立LAMP可视化方法的反应体系具体操作为：以每20-30μLLAMP反应体系为份，内引物(FIP、BIP)各1-1.5μmol/L，外引物(F3、B3)各0.1-0.3μmol/L，dNTP1.0-1.5mmoI/L2.5μL，MgSO47-10mmol/L，Betaine0.7-1mol/L1-3μL，l0×BstDNA聚合酶缓冲液，8U的BstDNA聚合酶0.8-1.2μL，煮沸后的MO菌液1-3μL，用纯水补足至25-30μL，反应条件：在55-65℃的反应温度，间隔1-2℃递增，各温度均反应0.5-1.5h，最后75-85℃作用3-8min终止反应。进一步地，上述步骤B所述优化后LAMP反应条件为：反应温度60-65℃，Mg2+浓度为7-9mmol/L、dNTP浓度为1.0-1.5mmol/L、甜菜碱Betaine浓度0.6-1mol/L，内外引物浓度比为5-7:1，反应时间为30-90min。进一步地，所述步骤C的具体操作为：用灭菌棉拭子涂擦绵羊鼻腔分泌物，置于灭菌的离心管中，共采集至少5个养羊场绵羊鼻拭子样品共60份以上，低温运送至实验室进行检测，含有灭菌棉拭子的离心管中加入1ml灭菌的生理盐水，充分振荡混合，取处理后的液体置于容器中，10000-14000r/min离心1-3min，灭菌蒸馏水洗涤两次以上，最后用200-400μLTE缓冲液悬浮，隔水煮沸10-20min，7000-10000r/min离心10-20min，取上清，即DNA模板溶液，用所建立的MO可视化LAMP反应对临床样品进行检测，统计检测方法的检测结果。本专利技术通过釆用环介导等温扩增(LAMP)技术可视化快速检测MO核酸。针对MO的髙保守特异性序列16SrDNA，设计4条LAMP引物，对Mg2+浓度、反应温度、dNTP浓度等多种反应条件进行优化后，确立了LAMP可视化方法的反应体系。利用本专利技术所设计的LAMP引物，分别对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌、表皮葡萄球菌、沙门氏菌等多种致病菌和临床样本的检测，证实所建立的MOLAMP可视化检测方法具有很高的特异性和敏感性，为绵羊MO感染的临床诊断提供了一个快速、简便、准确的检测方法。附图说明图1是本专利技术实施例LAMP可视化检测结果示意图；其中分别对应的DNA片段为：1、金黄色葡萄球菌；2,4、绵羊肺炎支原体；3、大肠杆菌；5、沙门氏菌。图2是本专利技术实施例LAMP特异性试验结果示意图；其中分别对应的DNA片段为：1、金黄色葡萄球菌；2、大肠杆菌；3、枯草芽孢杆菌；4、单核细胞增生李斯特菌；5、表皮葡萄球菌；6、沙门氏菌；7、绵羊肺炎支原体。图3是本专利技术实施例LAMP敏感性试验结果示意图；其中：M表示蛋白分子量标准1、表示菌液稀释倍数10-1；2、表示菌液稀释倍数10-2；3、表示菌液稀释倍数10-3；4、表示菌液稀释倍数10-4；5、表示菌液稀释倍数10-5；6、表示菌液稀释倍数10-6；7、表示菌液稀释倍数10-7；8、表示菌液稀释倍数10-8；具体实施方式本实施例以新疆维吾尔自治区牧场绵羊为标本，无菌培养并收集绵羊Eg头节，其他原材料通过购买试剂盒等所得。1、LAMP引物的设计根据MO16SrDNA序列，运用DNAMAN软件进行序列比对，筛选出MO高度保守的序列作为扩增的靶序列。按照LAMP技术的引物设计原理及反应原理，在PrimerExplorerV4软件系统设计产生的多对引物对，并筛选出合适的引物对进行引物合成。本研究所设计的引物对包括一对内引物(FIP-BIP)与一对外引物(F3-B3)，扩增目的基因片段长度为188bp，引物名称及序列见表1。表1LAMP特异性引物名称及序列3LAMP及PCR反应体系本实验所建立的25μLLAMP反应体系中，内引物(FIP、BIP)各1.2μmol/L，外引物(F3、B3)各0.2μmol/L，dNTP1.2mmoI/L2.5μL，MgSO48mmol/L，Betaine0.8mol/L2μL，l0×Bs本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，是通过以下过程实现的：A、根据所检测绵羊肺炎支原体的基因序列设计LAMP引物；B、确立LAMP可视化方法的反应体系，并对LAMP反应条件进行优化；C、将采集到的绵羊鼻腔分泌物，制取DNA模板溶液，用步骤B所得反应体系和反应条件进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，是通过以下过程实现的：A、根据所检测绵羊肺炎支原体的基因序列设计LAMP引物；B、确立LAMP可视化方法的反应体系，并对LAMP反应条件进行优化；C、将采集到的绵羊鼻腔分泌物，制取DNA模板溶液，用步骤B所得反应体系和反应条件进行检测。2.如权利要求1所述的快速检测绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，步骤A所设计的LAMP引物包括一对内引物与一对外引物，扩增目的基因片段长度为188bp。3.一种如权利要求2所述的快速检测绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，所述LAMP引物的序列分别为：内引物：FIP——CCTACCAACTAACTAAAAAATGGGGGTGCBIP——GATTGAGATACGGCCCGTAGGAGTCTGG外引物：F3——AAGGAGCCTTTAAAGCTCB3——GCAGCAGTAAGGAATAT。4.如权利要求1～3任一项所述的快速检测绵羊肺炎支原体的方法，其特征在于，步骤B确立LAMP可视化方法的反应体系具体操作为：以每20-30μLLAMP反应体系为份，内引物(FIP、BIP)各1-1.5μmol/L，外引物(F3、B3)各0.1-0.3μmol/L，dNTP1.0-1.5mmoI/L2.5μL，MgSO47-10mmol/L，Betaine0.7-1mol/L1-3μL，l...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔军，孟庆玲，田路路，卢海亭，乔梦凡，贡莎莎，陈诚，李重阳，孟丹，于伟伟，陈创夫，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65