本发明专利技术涉及一种生物检测试剂，以及这种检测试剂的制备方法，确切讲本发明专利技术涉及一种牛支原体抗体检测试剂及其制备方法。本发明专利技术的牛支原体抗体检测试剂由混合均匀的1份牛支原体P48重组表达的融合蛋白抗原和1份10%醛化-鞣酸化绵羊红细胞（v/v）构成。本发明专利技术的牛支原体抗体检测试剂所用的P48重组表达的融合蛋白抗原基因序列为SEQID№1。本发明专利技术可真实地检测牛支原体抗体；具有保存时间长、致敏效价高、易于长时间保存，血凝效价高，以及操作简单、方便快速，且价格低廉，安全稳定，无毒性，无环境污染等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物检测试剂，以及这种检测试剂的制备方法，确切讲本专利技术涉 及。
技术介绍
牛支原体是感染牛的一种重要的致病性病原体，1961年Hale在美国首次从患乳 腺炎的牛乳中分离到该病原，1976年首次报道与牛呼吸系统疾病有关。目前已证实牛支 原体除导致牛肺炎、乳腺炎外，还可导致关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不 孕等多种疾病。自2008年以来，我国部分地区新从外地引进肉牛暴发了以坏死性肺炎为 主要特征的传染性牛支原体肺炎疫情，发病率为50%-100%，病死率高达10%-50%，给 我国养牛业造成了巨大的经济损失。此后相继在我国甘肃、宁夏、青海、贵州、内蒙、湖北、重 庆、山东等省市均有临床诊断报道，危害严重。但遗憾的是，迄今这些报道大多为根据临床 表现和剖检变化做出的临诊报告，鲜见应用准确的实验室诊断技术。因此，本病在我国的实 际流行情况和准确的流行病学信息仍较为匮乏，造成这种现象的原因，主要是我国目前缺 乏有效的牛支原体检测的相关技术。 目前存在的检测牛支原体的技术有：1.病原分离鉴定，但是牛支原体分离往往受 到临床应用抗生素的影响，分离困难，且分离用培养基营养要求高、分离物鉴定难度大、灵 敏度低，不能作为早期快速诊断牛支原体感染的方法，也难以作为常规检测方法普及推 广（参见Caswell J L, Archambault M. Mycoplasma bovis pneumonia in cai:tle);2. PCR检测 方法（参见Thomas A, Dizier I, Linden A, et al . Conservation of the uvrC gene sequence in Mycoplasma bovis and its use in routine PCR diagnosis),该检测方法需要对病料样品 进行较复杂的处理(研磨、离心、提取DNA等)，检测方法虽灵敏，但容易因污染和处理不当比 较容易出现假阳性，影响判定结果的准确性，此外也需要一定的实验室条件和仪器设备，以 及较高成本，不适合临床或基层使用。3.间接ELISA是目前应用最主要的血清学检测方法， 国际上先后有用全菌蛋白包被和表达蛋白作为包被抗原的方法（出自Grand D L, Calavas D, Brank M, et al. Serological prevalence of Mycoplasma bovis infection in suckling beef cattle in France),全菌蛋白的方法特异性不足现已很少应用，表达蛋白抗原ELISA 方法目前已有商业化产品，但其所用哪一个抗原蛋白并未公布。此外，ELISA方法仅适合在 实验室进行检测，操作步骤相对复杂，需要专业人员进行操作，且需要一定的实验室条件和 仪器设备进行检测和分析结果。我们利用P48重组表达蛋白包被绵羊红细胞建立的间接血 凝检测方法，操作简单，无需特定的仪器设备，2~3小时即可判定结果，实验室检测和基层临 床均可应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决当前我国缺乏牛支原体抗体检测技术难题，提供一种牛 支原体抗体检测试剂及其制备方法，本专利技术同时提供用这种抗原制备间接血凝诊断试剂的 方法。 本专利技术的牛支原体抗体检测试剂由混合均匀的1份牛支原体P48重组表达的融合 蛋白抗原和1份10%醒化-縣酸化绵羊红细胞（v/v)构成。 本专利技术的牛支原体抗体检测试剂制备方法是： a. 将牛支原体p48基因合成到pet32a表达载体质粒中，得到阳性重组质粒 Pet32_a(+)_p48 ; b. 用重组质粒pet32a⑴-p48转化到感受态细胞BL21 (DE3)，挑取已转化到 BL21 (DE3)的单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养至0D值至0. 6左右，然后 吸取一定量的该菌液接种到的含氨苄青霉素的LB液体培养基诱导表达，收集菌体后过柱 纯化，得牛支原体P48融合蛋白； c. 用1份纯化的P48融合蛋白抗原与1份10%醒化-縣酸化绵羊红细胞（v/v)混合均 匀得到检测试剂。 本专利技术的牛支原体抗体检测试剂中使用的牛支原体P48重组表达的融合蛋白抗 原基因序列为SEQ ID Ns 1。 本专利技术的优点包括以下方面：（1)本专利技术中抗原P48为牛支原体膜蛋白，具有很强 的特异性，能真实地检测牛支原体抗体；（2)用蛋白致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞，避免了 新鲜绵羊红细胞保存时间短、致敏效价低的缺点，易于长时间保存，血凝效价高。（3)操作简 单、方便快速，无需特殊设备和仪器，全程在2?3小时内完成，适合在基层推广应用，可广 泛应用于牛支原体病流行病学的调查研究。（4)结果的重复性好，稳定，可靠，能够准确的检 测牛支原体的抗体。（5)本专利技术的检测牛支原体抗体的诊断试剂，且价格低廉，安全稳定，无 毒性，无环境污染。（6)由于本专利技术中对P48基因进行了优化改造，使其可在感受态细胞中 高效表达。 【附图说明】 图1诱导温度37°C，lmmol/LIPTG浓度，重组菌(将阳性重组质粒pet32a⑴-p48 转化入表达菌BL21 (DE3)的阳性菌命名为重组菌)诱导表达6h，蛋白表达的电泳图，试验中 每孔上样均7uL，图中：泳道1为蛋白marker ;泳道2为未诱导表达菌；泳道3为诱导表达 菌；泳道4为诱导表达菌超声沉淀；泳道5为诱导表达菌诱导上清。 图2优化表达条件：诱导温度16°C，0. lmmol/LIPTG浓度，重组菌诱导表达16h，蛋 白表达的电泳图，试验中每孔上样量均为7uL，图中：泳道1.诱导菌超声沉淀；泳道2.诱导 菌超声上清；泳道3.诱导表达菌；泳道4.未诱导表达菌；泳道5.蛋白maker。 【具体实施方式】 本专利技术以下结合实施例进行详细解说。 一、牛支原体P48重组表达的融合蛋白抗原的制备 a.牛支原体p48基因的合成及重组质粒鉴定 对已公开的牛支原体p48基因（Genebank: NC_014760. 1)密码子进行优化，按照密码子 在大肠杆菌的嗜好进行优化，同时将在牛支原体该序列中的4个表达色氨酸的TGA (UGA) 优化成TGG (UGG)，因为该密码子在大肠杆菌中为终止密码子，同时在其两端加上了酶切位 点BamH I和Xho I，经优化后的基因序列为SEQ ID Ns 1 ; 将优化后的p48基因序列交由Invitrogen公司合成到pet32a表达载体质粒中，合成 后，进行测序鉴定，酶切鉴定，将鉴定成功后的阳性重组质粒命名为Pet32_a (+) -p48。 b.牛支原体P48融合蛋白的可溶性表达 1. 1培养基配制 配制含氨苄青霉素的LB液体培养基2000ml。胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，氯化钠 200g，加入约1600ml的去离子水，充分搅拌溶解。滴加5N NaOH(约0. 4ml)，调节pH值至 7. 0。加入去离子水将培养基定容至2L，高温高压灭菌，待培养基放凉后，加入氨苄青霉素， 使其浓度达l〇〇ug/mL，放入4度保存备用。 1.2P48蛋白的表达 首先，将带有目的基因的重组质粒pet32a (+)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种由混合均匀的1份牛支原体P48融合蛋白抗原和1份10%醛化‑鞣酸化绵羊红细胞（v/v）构成。
【技术特征摘要】
1. 一种由混合均匀的1份牛支原体P48融合蛋白抗原和1份10%醛化-鞣酸化绵羊红 细胞（v/v)构成。2. 权利要求1所述的牛支原体抗体检测试剂制备方法，其特征在于： a. 将牛支原体p48基因合成到pet32a表达载体质粒中，得到阳性重组质粒 Pet32_a(+)_p48 ; b. 用重组质粒pet32a⑴-p48转化到感受态细胞BL21 (DE3)，挑取已转化到 BL21 (DE3)的单菌落接种...
【专利技术属性】
技术研发人员：储岳峰，逯忠新，简莹娜，赵萍，贺英，陈胜利，刘永生，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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