肺炎支原体耐药诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种肺炎支原体耐药诊断试剂盒。该试剂盒包括上游引物序列P1：5'TCCAGGTACGGGTGAAGACA'3；下游引物序列P2：5'GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT'3；探针序列T1：5'ACGGAAAGACCCC'3，VIC标记；探针序列T2：5'CGGGAAGACCCC'3，FAM标记。本发明专利技术提供的肺炎支原体耐药诊断试剂盒通过建立荧光定量PCR等位基因鉴别方法，对MP2063位点的基因型进行鉴定，在快速诊断的同时判断其耐药性，检测灵敏度较好。

【技术实现步骤摘要】
肺炎支原体耐药诊断试剂盒
本专利技术涉及一种PCR检测试剂盒，更具体地说，涉及一种实时定量的肺炎支原体耐药诊断试剂盒。
技术介绍
肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae，简称为MP）是儿童、青少年及成人上、下呼吸道感染的常见病原体。23%～50%的学龄前儿童和青少年社区获得性肺炎是由MP感染导致的，流行周期为3～7年。肺炎支原体肺炎易复发或迁延不愈，重症患者常合并肺外症状，对健康危害严重。MP无细胞壁结构，临床上只能选择抑制或影响其蛋白质和核酸合成的药物，如大环内酯类抗生素、四环素类抗生素、喹诺酮类抗生素等。但由于其他抗生素的不良反应，治疗儿童MP感染首选大环内酯类抗生素。自2001年发现对大环内酯类抗生素耐药的MP以来，MP耐药率逐年升高且流行范围逐渐扩大，已有多个国家或地区分离到MP耐药株。据文献报道，日本2007年MP耐药率已高达40%以上，韩国儿童住院患者MP耐药率为61.3%，意大利为26%，法国为9.8%，德国为3%。中国MP耐药形势则更为严峻，MP临床分离株中92%以上大环内酯类抗生素耐药。MP的耐药机制主要是核糖体大亚基23SrRNA的基因突变和核糖体蛋白L4、L22基因突变，其中23SrRNA结构域V区的2063位点和2064位点的点突变占主导地位。我国发现的耐药MP中2063A-G突变占97%以上。目前，临床上常用的MP诊断方法为MP培养、血清学检测和PCR。MP培养耗时长，阳性率低，耐药性的监测通常需要体外培养并进行药敏试验，测定最小抑菌浓度（MIC）。血清学检测方法简便易行，但需要患者恢复期血清做对照，急性期诊断效果不佳。常规PCR方法具有快速、阳性率高的优点，但存在假阳性的问题。荧光定量PCR以特异性强、定量准确、重复性好等优点而得到迅速发展，但其并不能判断病原体耐药性，对临床治疗的指导意义有限。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种肺炎支原体耐药诊断试剂盒。该试剂盒可以通过建立荧光定量PCR等位基因鉴别方法，对MP2063位点的基因型进行鉴定，在诊断的同时判断其耐药性。为实现上述的专利技术目的，本专利技术采用下述的技术方案：一种肺炎支原体耐药诊断试剂盒，包括：上游引物序列P1：5'TCCAGGTACGGGTGAAGACA'3；下游引物序列P2：5'GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT'3；探针序列T1：5'ACGGAAAGACCCC'3，VIC标记；探针序列T2：5'CGGGAAGACCCC'3，FAM标记。本专利技术提供的肺炎支原体耐药诊断试剂盒通过建立荧光定量PCR等位基因鉴别方法，对MP2063位点的基因型进行鉴定，在快速诊断的同时判断其耐药性，从而指导临床实践。该诊断试剂盒的检测灵敏度较好，临床应用前景巨大。附图说明图1为MP标准株FH、耐药株307及构建的标准质粒PCR结果。其中，1为MP标准株FH，2为耐药株307，3为敏感2063A质粒，4为耐药2063G质粒，N为阴性对照，P为阳性对照；M为100bpDNALadder。图2为实时荧光定量PCR标准曲线。图3显示了实时荧光定量PCR鉴定2063等位基因的诊断价值。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。肺炎支原体（MP）是引起儿童肺炎和肺外并发症的一种常见病原体。目前儿童MP感染的主要治疗药物为大环内酯类抗生素。近年来国内、国际临床上越来越多分离到耐大环内酯类抗生素的MP株，主要耐药机制是核糖体大亚基的23SrRNA的编码基因突变。在我国，目前报道97%以上的耐药株为2063A→G突变。自2000年第一次报道实时定量PCR诊断MP以来，已有大量的针对不同扩增序列的实时定量PCR诊断方法研究出现，也出现很多市售试剂盒。但这些方法只能给出阳性或阴性结果，不能获得耐药信息。因此，本专利技术针对导致MP耐药2063位A→G的点突变，设计引物和探针，建立MP耐药诊断一步法的试剂盒。下面对此展开详细具体的说明。1材料与方法1.1标本1.1.1MP标准株MP标准株FH（ATCC15531）、人型支原体（ATCC27813）为首都医科大学附属北京友谊医院热带医学研究所实验室储存；梨形支原体、穿通支原体、生殖支原体由东南大学公共卫生学院王蓓教授馈赠。1.1.2MP临床分离株MP临床分离株分离自2010年2月～2011年2月就诊于首都医科大学附属北京友谊医院儿科（住院部和门诊）、首都医科大学附属北京朝阳医院儿科（住院部）的43例疑似肺炎支原体肺炎患儿的呼吸道咽拭子标本。鼻咽拭子标本12份采集自2012年12月就诊于北京大学第三医院儿科疑似MPP的病例。1.1.3比对菌株绿脓杆菌（ATCC27853）、大肠埃希菌（ATCC25922）、阴沟肠杆菌（ATCC700323）、金黄色葡萄球菌（ATCC25922）、肺炎克雷伯临床分离株（1705）由首都医科大学附属北京友谊医院检验科馈赠。1.2试剂小牛血清、酵母提取物、葡萄糖、氨苄青霉素、IPTG、X-Gal、琼脂糖、胰蛋白胨均购自北京环亚泰克生物有限公司；2×TapplusPCRGreenMix购自Takara公司；pGEM-TEasyVectorSystemsⅡ购自Promega公司；QIAampDNAminikitDNA提取试剂盒购自Qiagen公司；PCR产物回收试剂盒及质粒纯化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；荧光定量PCRGenotypingmix购自美国ABI公司。1.3荧光定量PCR1.3.1DNA模板提取取200μL对数期生长的培养MP，20000g，离心20min；200μLPBS沉淀重悬；QIAampDNAminikit提取DNA模板。接种环无菌挑取菌落至200μLPBS中，QIAampDNAminikit提取DNA模板。对提取咽拭子标本的灭菌棉签用MP培养液浸泡，经反复涮洗挤压后弃掉棉签，将浸泡液以20000g，离心10min，弃去上清液后加标本处理液50μL，并充分混匀，置100℃沸水中水浴10min，此溶液作为DNA模板备用。1.3.2引物序列与探针序列根据MP标准株M129序列（NC_000912.1）23SRNA突变位点设计上下游引物及探针；上游引物序列P1：5'TCCAGGTACGGGTGAAGACA'3（SEQIDNO.1），下游引物序列P2：5'GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT'3（SEQIDNO.2），探针序列T1：5'ACGGAAAGACCCC'3（SEQIDNO.3），VIC标记；T2：5'CGGGAAGACCCC'3（SEQIDNO.4），FAM标记。引物序列和探针序列均由英潍捷基贸易有限公司合成。1.3.3PCR反应体系：2×缓冲液10.0μL，10μmol/L的引物P31.0μL，10μmol/L引物P41.0μL，模板DNA1.0μL，ddH2O7.0μL。反应条件：93℃变性2min；9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺炎支原体耐药诊断试剂盒，其特征在于包括：上游引物序列P1：5'TCCAGGTACGGGTGAAGACA'3；下游引物序列P2：5'GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT'3；探针序列T1：5'ACGGAAAGACCCC'3，VIC标记；探针序列T2：5'CGGGAAGACCCC'3，FAM标记。

【技术特征摘要】
2013.10.30 CN 201310526965.X1.一种肺炎支原体耐药诊断试剂盒，其特征在于包括：上游引物序列P1：5'TCCAGGTACGGGTGAAGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛德莉，李静宜，孙岚，郭东星，姜越，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京友谊医院，
类型：发明
国别省市：北京;11