本发明专利技术公开了一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术的中药材金银花真伪品快速检测技术。一种金银花检测用引物，能扩增目标核酸序列的特异碱基，所述目标核酸序列为叶绿体序列trnL-trnF。所述引物与所述目标核酸序列的582-661位核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明专利技术通过提供一种对金银花特定位点具有特异性的引物组，及其用含有上述引物组的试剂盒检测样本中是否存在金银花特定位点，进而确定样本中是否存在正品金银花。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种基于环介导等温扩增(loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)技术的中药材金银花真伪品快速检测技术。一种金银花检测用引物，能扩增目标核酸序列的特异碱基，所述目标核酸序列为叶绿体序列trnL-trnF。所述引物与所述目标核酸序列的582-661位核酸序列的一部分或其互补链互补。本专利技术通过提供一种对金银花特定位点具有特异性的引物组，及其用含有上述引物组的试剂盒检测样本中是否存在金银花特定位点，进而确定样本中是否存在正品金银花。【专利说明】金银花检测用引物、检测方法、检测试剂盒
本专利技术涉及一种用环介导等温扩增技术快速检测金银花的方法，属于分子生物学
。
技术介绍
经过市场调研及有关专家确认可作为中药材金银花的伪品有灰毡毛忍冬(Loniceramacranthoides Hand.-Mazz.)、红腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq.)、华南忍冬(LoniceraConfusa DC.)或黄褐毛忍冬(Lonicera fulvotomentosa HsuetS.C.Cheng)等(郝近大，实用中药材经验鉴别，人民卫生出版社，2009)。在中华人民共和国药典(2010版)中主要收录的药材鉴别方法有性状鉴别、薄层鉴别等方法，然而金银花和其伪品灰毡毛忍冬、华南忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬等在外形特征上非常相似，因此采用性状鉴别具有一定的主观性，且要求鉴别者具有丰富的鉴别经验；如果药材外形不完整或者破碎后鉴别也十分困难。另一方面，由于伪品灰毡毛忍冬、华南忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬等中均含有指标性成分绿原酸，因此采用薄层鉴别也无法把金银花及其伪品区分开来。近年来发展的以分子生物学为基础的检测方法如DNA条形码、位点特异性PCR等尽管克服了传统鉴别方法准确度不高、主观性大等缺点，在实验室条件下实现了金银花药材的准确检测，但是由于常规PCR需要昂贵的PCR仪或测序仪以及凝胶电泳以及成像系统等，大大限制了这些检测方法的推广应用。因此，建立适用于中药材的准确、快速、低成本的检测方法一直是中药鉴定领域中亟待解决的问题。环介导等温扩增 技术(LAMP)是Notami等人在2000年提出的一种等温扩增新技术。该技术针对目的基因的6个区域设计模板依赖的特异性引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在一定温度下进行等温扩增。LAMP法通过4引物识别目的基因的6个区域，使用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件(60-701:)下进行核酸的指数级扩增，通过在扩增反应中产生茎环结构引发下一轮引物结合，LAMP能在60-90min内把目的片段扩增到IO9数量级。目前尚未见到利用LAMP技术检测中药材金银花中忍冬的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可供检测金银花药材是否含有正品忍冬的环介导等温扩增方法及其试剂盒，以实现在药市、药房、产地等快速、特异、灵敏、简便的检测金银花中是否含有忍冬。本专利技术所采用的技术方案是首先通过生物信息学分析忍冬及其伪品的序列差异，基因序列如忍冬trnL-trnF序列(GenBank登录号:HM228586.1)所示,通过专业软件设计用于环介导等温扩增检测忍冬的特异性寡核苷酸引物，以引物序列组扩增待测样品模板DNA,进行目的片段的特异性扩增，其检测方法步骤包括:(I)基因组DNA提取步骤,从待检样品中提取I旲板DNA。(2)环介导等温扩增步骤，将上述模板DNA加入LAMP反应体系内进行环介导等温扩增，其中所使用引物序列如下:正向外引物LJ-F3: 5，-AGGGTTCAAGTCCCTCTA-3 ’反向外引物LJ-B3:5’ -CGTATTATCTTAGATCACAAGACT-3’正向内引物LJ-FIP: 5，-GGAACCGCTAACAAAAAAAGGACCAAAAAACCCATATTGACTCC-3 ’反向内引物LJ-BIP:5’ -CTAATTCGTTATATTTCTCATCCACCTGAGAAAAACATTTCCGCTC-3’反应体系包括:2.5 μ LlOXThermoPol缓冲液，2个内引物LJ-FIP和LJ-BIP的终浓度为I~2μΜ，两个外引物LJ-F3和LJ-B3的终浓度为0.1~0.4 μ M，dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1-2.5mM，甜菜碱0.5-3M，待检样品DNA l-100ng,Bst DNA聚合酶5-20U。混匀后在约 63-68°C 内保温 50-90min，然后 80°C保温 lOmin。(3) LAMP反应结束后，在反应体系内加入10-10000倍稀释的SYBR Green I染料，然后在紫外灯下检测被检样品LAMP反应产物的颜色，如果颜色为绿色或黄绿色则表示检测药材中存在忍冬，如果是其他颜色则表示检测药材不存在忍冬。本专利技术所提供的忍冬检测方法具有以下优点:(I)检测时间短，仅1-2小时内即可获得检测结果，比现有的分子生物学检测方法缩短2-3小时。(2)仪器要求宽松，不需要普通PCR所用的PCR仪、电泳槽及凝胶成像系统，只要一个水浴锅即可完成检测反应，可实现现场检测。(3)操作简单，整个过程不涉及复杂的仪器设备，检测结果清晰，只用肉眼观察颜色即可判断。为了能更清晰地说明本专利技术的提取方法，下面结合具体实施案例，对本专利技术的检测方法进行进一步阐述。`为了建立忍冬的LAMP检测方法，首先要选择忍冬所特有的核苷酸序列，然后进行LAMP引物的设计和合成。研究表明忍冬trnL-TrnF序列(GenBank登录号:HM228586.1)可作为忍冬的特异性核苷酸序列，用于忍冬的鉴定和检测。通过引物设计软件primerexplorer4.0 (https://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/)设计 LAMP 弓丨物。其中所设计引物序列如下:正向外引物LJ-F3:5’ -AGGGTTCAAGTCCCTCTA-3’反向外引物LJ-B3:5’ -CGTATTATCTTAGATCACAAGACT-3’正向内引物LJ-FIP: 5，-GGAACCGCTAACAAAAAAAGGACCAAAAAACCCATATTGACTCC-3 ’反向内引物LJ-BIP:5’ -CTAATTCGTTATATTTCTCATCCACCTGAGAAAAACATTTCCGCTC-3’按照上述序列进行引物LAMP合成，即可进行LAMP检测。【专利附图】【附图说明】图1:忍冬及其伪品LAMP反应紫外检测结果I:SYBR Green I (阴性对照)；2:红腺忍冬(伪品)；3:华南忍冬(伪品)；4:忍冬；5:忍冬具体实施例1检测方法1.材料和方法1.1 材料所用材料如表1所示,包括:表1金银花相关样品基本情况【权利要求】1.一种金银花检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成: 正向外引物 LJ-F3:5’ -AGGGTTCAAGTCCCTCTA-3’ 反向外引物 U-B3:5’ -CGTATTATCTTAGATCACAAGACT-3’正向内引物 LJ-FIP:5’ -GGAACCGCTAACAAAAAAAGGACCAAAAAACCCATATTGAC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种金银花检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：正向外引物LJ‑F3：5’‑AGGGTTCAAGTCCCTCTA‑3’反向外引物LJ‑B3：5’‑CGTATTATCTTAGATCACAAGACT‑3’正向内引物LJ‑FIP：5’‑GGAACCGCTAACAAAAAAAGGACCAAAAAACCCATATTGACTCC‑3’反向内引物LJ‑BIP：5’‑CTAATTCGTTATATTTCTCATCCACCTGAGAAAAACATTTCCGCTC‑3’可以扩增忍冬trnL‑trnF基因GenBank登录号：HM228586.1，582‑661位的特异性核酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，袁媛，蒋超，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。