一种药物性耳聋的检测引物组、其构成的反应体系及应用制造技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种药物性耳聋的检测引物组及其构成的反应体系，所述检测引物组如下：正向外侧引物F3C：SEQ ID NO:1；反向外侧引物B3C：SEQ ID NO:2；正向内侧引物FIPC：SEQ ID NO:3；反向内侧引物BIPC：SEQ ID NO:4。本发明专利技术步骤简单、扩增反应快速、高效、特异性高、鉴定简便，使该技术有着更广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种药物性耳聋的检测引物组、其构成的反应体系及应用。
技术介绍
药物中毒性耳聋(简称药物性耳聋)，是指患者因使用或接触某些耳毒性药物而造成的耳聋，这些药物(包括氨基糖苷类抗菌素、非氨基糖苷类抗菌素、水杨酸盐等)均对人类听觉神经具有毒副作用，可破坏耳蜗，一般造成双侧、永久性耳聋，多不可逆。根据中国2006年第二次全国残疾人抽样调查结果显示，听力残疾患者人数约2004万人，占全国8296万残疾人总数的24.16％，其中药物致聋的人数多达800万。其中，氨基糖苷类抗生素的不恰当使用是造成药物性耳聋发生的最常见因素，这类抗生素包括常见的链霉素、庆大霉素等。另外有研究结果表明，人类线粒体基因突变的发生与药物性耳聋密切相关。在中国人群中，线粒体基因的A1555G、C1494T这两个位点突变的发生频率高达4％。A1555G突变和C1494T突变会在12SrRNA的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1494U-A1555碱基对。这些改变使得12SrRNA在二级结构上与细菌的16SrRNA的相应区域的二级结构更加相似，导致糖苷类药物与之发生“不应该”的结合，引起细胞膜上的Na+，K+-ATP泵功能障碍，造成毛细胞损伤，导致药物性听力受损甚至耳聋。目前用于检测这两个位点突变的方法有很多种，如Sanger测序法，这种方法可以很直观得得到目的位点的突变情况，然而操作复杂，需要两次PCR和大量的纯化工作，并且费用高昂，耗时较长，不适合大范围推广使用；等位基因特异性PCR法，这种方法通过设计突变型和野生型特异的PCR引物，通过电泳比较野生型和突变型PCR产物的大小不同以判定检测样本的突变状况，优点是费用低廉，然而大规模检测时样本量较大，同时进行大量的电泳操作就会变得非常繁琐，而且容易造成交叉污染；荧光定量PCR法灵敏度高，不需要人工检测，因此目前应用比较广泛，然而它依然不能摆脱对昂贵的设备的依赖，同时，用于检测的探针也是一笔不小的支出。因此，非常有必要开发一种既能快速准确又能价格低廉的检测方法。环介导的等温扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等温扩增技术，其主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下进行恒温扩增，仅需15-90分钟即可产生109-1010数量级的产物。LAMP反应对模板DNA的质量要求远没有PCR反应严格，因此DNA的粗提物就可以直接作为检测模板，比起以PCR为基础的检测方法具有更大的优势，可免去DNA提取的成本和繁琐操作的步骤，尤其是在大量样本的检测中，这种优势就更加明显。同PCR反应一样，LAMP的反应也需要引物3端与模板的严格配对，具有敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定的优点。
技术实现思路
本专利技术为了克服上述方法的缺陷，提供一种药物性耳聋的检测引物组、其构成的反应体系及应用，所述检测体系具有敏感性高、特异性好和操作简便等优点。为达到此专利技术的目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种药物性耳聋的检测引物组，其特征在于，所述检测引物组如下：正向外侧引物F3C：SEQIDNO:1：GGCAAGAAATGGGCTACA；反向外侧引物B3C：SEQIDNO:2：CGTAGGGGTTTTAGTTAAATGTC；正向内侧引物FIPC：SEQIDNO:3：TGCTAAATCCACCTTCGACCTCTACCCCAGAAAACTACGAT；反向内侧引物BIPC：SEQIDNO:4：TAAGAGTAGAGTGCTTAGTTGAACACTTTGAAGTATACTTGAGGATG；正向外侧引物F3T：SEQIDNO:5：AAACTTAAGGGTCGAAGGTGG；反向外侧引物B3T：SEQIDNO:6：CTGGTTCGTCCAAGTGCA；正向内侧引物FIPT：SEQIDNO:7：AGGGACGGGCGGTGTGTACGAGCAGTAAACTAAGAGTAGAGTGC；反向内侧引物BIPT：SEQIDNO:8：AGGACATTTAACTAAAACCCCTACGCATCCAGTACACTTACCATGTTACG；正向外侧引物F3A：SEQIDNO:9：CGAAGGTGGATTTAGCAGTA；反向外侧引物B3A：SEQIDNO:10：CCTAAGTGTAAGTTGGGTGC；正向内侧引物FIPA：SEQIDNO:11：TGTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGGGAGTAGAGTGCTTAGTTGAAC；反向内侧引物BIPA：SEQIDNO:12：ACCAGTCGTAACATGGTAAGTGTACTTGTGTTAAGCTACACTCTGG；正向外侧引物F3G：SEQIDNO:13：TCAAGTATACTTCAAAGGACATT；反向外侧引物B3G：SEQIDNO:14：AGTAAGGTGGAGTGGGTT；正向内侧引物FIPG：SEQIDNO:15：CCAAGTGCACTTTCCAGTACACCTACGCATTTATATAGAGGATGC；反向内侧引物BIPG：SEQIDNO:16：GAACCAGAGTGTAGCTTAACACAAAGCTAGGTTTAGCTCAGAGC。优选地，所述SEQIDNO:1-4所示的序列是用于检测1494位点的C等位基因。优选地，所述SEQIDNO:5-8所示的序列是用于检测1494位点的T等位基因。优选地，所述SEQIDNO:9-12所示的序列是用于检测1555位点的A等位基因。优选地，所述SEQIDNO:13-16所示的序列是用于检测1555位点的G等位基因。本专利技术根据LAMP的特点，针对线粒体12sRNA上1494和1555位点的不同突变碱基设计特异性引物，既保留了LAMP反应的优势，又具有非常高的特异性。外侧引物记为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3，内侧引物记为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP，其中FIP包含了F1c和F2，BIP包含了B1c和B2，上述引物均由在线软件PrimerExplorerV4设计。本专利技术在普通LAMP的基础上，针对1555和1494位点设计等位基因特异引物，特异性引物位于F1c或B1c的5’端，在F1c或B1c的5’端第三位再引进一个突变，进一步降低非特异性扩增的可能性。第二方面，本专利技术提供一种检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种药物性耳聋的检测引物组，其特征在于，所述检测引物组如下：正向外侧引物F3C：SEQ ID NO:1；反向外侧引物B3C：SEQ ID NO:2；正向内侧引物FIPC：SEQ ID NO:3；反向内侧引物BIPC：SEQ ID NO:4；正向外侧引物F3T：SEQ ID NO:5；反向外侧引物B3T：SEQ ID NO:6；正向内侧引物FIPT：SEQ ID NO:7；反向内侧引物BIPT：SEQ ID NO:8；正向外侧引物F3A：SEQ ID NO:9；反向外侧引物B3A：SEQ ID NO:10；正向内侧引物FIPA：SEQ ID NO:11；反向内侧引物BIPA：SEQ ID NO:12；正向外侧引物F3G：SEQ ID NO:13；反向外侧引物B3G：SEQ ID NO:14；正向内侧引物FIPG：SEQ ID NO:15；反向内侧引物BIPG：SEQ ID NO:16。

【技术特征摘要】
1.一种药物性耳聋的检测引物组，其特征在于，所述检测引物组如下：
正向外侧引物F3C：SEQIDNO:1；
反向外侧引物B3C：SEQIDNO:2；
正向内侧引物FIPC：SEQIDNO:3；
反向内侧引物BIPC：SEQIDNO:4；
正向外侧引物F3T：SEQIDNO:5；
反向外侧引物B3T：SEQIDNO:6；
正向内侧引物FIPT：SEQIDNO:7；
反向内侧引物BIPT：SEQIDNO:8；
正向外侧引物F3A：SEQIDNO:9；
反向外侧引物B3A：SEQIDNO:10；
正向内侧引物FIPA：SEQIDNO:11；
反向内侧引物BIPA：SEQIDNO:12；
正向外侧引物F3G：SEQIDNO:13；
反向外侧引物B3G：SEQIDNO:14；
正向内侧引物FIPG：SEQIDNO:15；
反向内侧引物BIPG：SEQIDNO:16。
2.根据权利要求1所述的检测引物组，其特征在于，所述SEQIDNO:1-4
所示的序列是用于检测1494位点的C等位基因；
优选地，所述SEQIDNO:5-8所示的序列是用于检测1494位点的T等位基
因；
优选地，所述SEQIDNO:9-12所示的序列是用于检测1555位点的A等位
基因；
优选地，所述SEQIDNO:13-16所示的序列是用于检测1555位点的G等
位基因。
3.一种检测药物性耳聋的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括权利
要求1或2所述的引物组，反应缓冲液，dNTPs，羟基萘酚蓝，甜菜碱，BstDNA
聚合酶，待检样品基因组DNA和去离子水。
4.根据权利要求3所述的反应体系，其特征在于，所述反应缓冲液包括
Tris-HCl，KCl，(NH4)2SO4，MgSO4和Tween-20；
优选地，所述Tris-HCl的浓度为10-30mM，优选为15-25mM，进一步优
选为20mM；
优选地，所述KCl的浓度为10-60mM，优选为50-55mM，进一步优选为
50mM；
优选地，所述(NH4)2SO4的浓度为5-13mM，优选为8-12mM，进一步优选
为10mM；
优选地，所述MgSO4的浓度为2-8mM，优选为2-6mM，进一步优选为4
mM；
优选地，所述Tween-20的体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：张井存，汪大为，
申请(专利权)人：北京晋祺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11