一种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法，该LAMP引物组序列分别为引物F3：5’‑ACGGAGGTAAAATTGGACA‑3’；引物B3：5’‑TCCCTTTAGCTTTTTTTTTAGC‑3’；FIP：5’‑GAGATGTAGTTGGTGAGTCTGTTTTTTTTTCTTCAGAGCAAAGCGTG‑3’；引物BIP：5’‑CAACCAGAGGTAAGAAGATCGCTTTTAAAAATATGTCTTGGAGCAGGT‑3’。本发明专利技术还提供了含有上述引物组的检测试剂盒及检测方法，通过向LAMP反应产物中加入荧光染料后的颜色变化来判断被测样品是否含有PPV，实现了可视化，反应结果易判定，非常易于临床推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽用生物制品领域，具体涉及一种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。
技术介绍
猪细小病毒(Porcine Parvoviru，PPV)，它是属于细小病毒科的细小病毒属。猪细小病毒会引起猪的一种繁殖障碍性疾病，受到该病感染的母猪，特别是受到该病感染的初产母猪会出现产死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪、偶有流产的特征，而母猪本身并无明显症状。猪细小病毒病在世界各地分布广泛并且在大多数猪场流行，猪细小病毒可以通过多种途径对猪感染，比如水源、食物、交配和胎盘等。猪细小病毒对热、消毒药和酸碱的抵抗力均很强，pH适应范围很广。病毒对外界环境的抵抗力也很大，能在被污染的猪舍内生存数月之久，容易造成长期连续传播。当被污染的圈舍按照常规消毒方法处理后，再放入易感染猪时，仍有被病毒感染的可能。由于该病难以防治，给养猪业带来巨大损失和危害，因此，建立一种快速、特异、灵敏并且适合在基层推广的检测方法就非常必要，将这种检测方法研制成试剂盒进行推广使用更具有很强的实用价值。国内外猪细小病毒现有常用诊断技术主要包括：临床诊断、病原诊断、血清学诊断、分子生物学诊断等。临床诊断主要依据流行病学、临床症状和尸体剖检来判断疾病种类，难以做到确诊。病原分离是最经典和可靠的病原诊断方法，特异性高，可直接确诊，但病毒分离所需时间较长，成本较高。血清学诊断技术主要包括：血清中和试验(Neutralization test,NT)、凝集性试验(Agglutination test,AT)、荧光抗体技术(Fluorescent-labelled abtibody technic,FA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点金免疫渗滤法、胶体金免疫层析法(Colloidal gold immimochromatography assay,CGICA)等。应用最多的血清学方法主要是ELISA，该方法具有灵敏、特异性强、快速、简便等特点，常被用于大规模的血清学检查，且目前己经建立了检测PPV的ELISA方法。但由于PPV已经在猪场广泛存在，所以，ELISA的检测结果不能作为判定猪群发生猪细小病毒相关疾病的决定性依据。分子生物学诊断技术包括聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence Quantitative PCR,FQ-PCR)、实时荧光定量RT-PCR(Real-time fluorescence Quantitative RT-PCR,RQ-RT-PCR)、环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术、依赖于核酸序列扩增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)技术、核酸探针技术、基因芯片检测技术等。核酸探针技术特异性强，准确可靠，可用于不同毒株的分离和鉴定，但诊断费用较高。基因芯片包括cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因组芯片等，主要目标是用于DNA序列的测定、基因表达谱鉴定、基因突变体的检测分析，以及基因组的功能研究等。它们都是比较理想的检测方法，但是也存在耗时费力、设备要求特殊等局限性。LAMP是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测猪细小病毒(PPV)的LAMP引物组、试剂盒及检测方法，利用LAMP技术，实现猪细小病毒的可视化、快速检测。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是：一种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组，其包括如下引物：本专利技术所述用于检测猪细小病毒的LAMP引物组在制备猪细小病毒的LAMP检测试剂盒中的应用。本专利技术所述包含上述LAMP引物组的猪细小病毒的LAMP检测试剂盒。本专利技术所述LAMP检测试剂盒还包括LAMP反应体系：该LAMP反应体系包括：MgSO4、dNTP、buffer缓冲液、引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、甜菜碱、模板、Bst酶。优选的，所述25μL LAMP反应体系中各成分的用量为：MgSO4：20-30nmol，dNTP：0.5-1.0nmol，10×buffer，引物FIP：5-40pmol，引物BIP：5-40pmol，引物F3：2.5-40pmol，引物B3：2.5-40pmol，甜菜碱：15-25μmol，Bst酶：6.4-9.6U。更优选的，所述25μL LAMP反应体系中各成分的用量为：MgSO4：20nmol，dNTP：1.0nmol，10×buffer，FIP：5pmol，BIP：5pmol，F3：20pmol，B3：20pmol，甜菜碱：25μmol，Bst酶：9.6U。本专利技术所述LAMP检测试剂盒还包括：显色剂、阳性对照、无模板对照。优选的，所述显色剂为SYBR Green I染料；所述阳性对照为PPV质粒。本专利技术所述LAMP检测试剂盒的检测反应程序为：首先59-65℃恒温30-60min，再80-85℃恒温3-5min。优选的，所述LAMP检测试剂盒的检测反应程序为：首先59℃恒温45min，再80℃恒温3min。一种检测猪细小病毒的LAMP检测方法，其包括如下步骤：1)提取猪细小病毒DNA作为反应模板；2)配制LAMP检测体系LAMP检测体系包含如下成分，按总体积25μL配制：MgSO4：20-30nmol，dNTP：0.5-1.0nmol，10×buffer，引物FIP：5-40pmol，引物BIP：5-40pmol，引物F3：2.5-40pmol，引物B3：2.5-40pmol，甜菜碱：15-25μmol，Bst酶：6.4-9.6U；还包括步骤1)提取的DNA模板；3)LAMP反应LAMP反应程序为：首先59-65℃恒温30-60min，再80-85℃恒温3-5min；4)步骤3)LAMP反应结束后，向反应物中加入SYBR Green I染料，观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有猪细小病毒；显色为橘红色的样品为阴性，不含猪细小病毒。优选的，所述LAMP检测体系中各成分的用量为：MgSO4：20nmol，dNTP：1.0nmol，10×buffer，FIP：5pmol，BIP：5pmol，F3：20pmol，B3：20pmol，甜菜碱：25μmol，Bst酶：9.6U。优选的，所述LAMP反应程序为：首先59℃恒温45min，再80℃恒温3min。本专利技术利用LAMP技术建立针对猪细小病毒的检测方法，该方法具有多引物同时扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于LAMP反应操作步骤简单及反应产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀，荧光剂显色后可以用肉眼观察判定反应结果，适用于各种实验条件下检测工作的使用。本专利技术根据LAMP的工作原理，以PPV的VP1基因为目标基因，在优化相关反应条件的基础上，建立了适用于临床应用的用于检测猪细小病的LAMP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组，其包括如下引物：
【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组，其包括如下引物：2.如权利要求1所述用于检测猪细小病毒的LAMP引物组在制备猪细小病毒的LAMP检测试剂盒中的应用。3.一种包含权利要求1所述的LAMP引物组的猪细小病毒的LAMP检测试剂盒。4.根据权利要求3所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP检测试剂盒包含LAMP反应体系，该LAMP反应体系包括：MgSO4、dNTP、buffer、引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、甜菜碱、模板、Bst酶。5.根据权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述25μL LAMP反应体系中各成分的用量为：MgSO4：20-30nmol，dNTP：0.5-1.0nmol，10×buffer，引物FIP：5-40pmol，引物BIP：5-40pmol，引物F3：2.5-40pmol，引物B3：2.5-40pmol，甜菜碱：15-25μmol，Bst酶：6.4-9.6U。6.根据权利要求4或5所述的猪细小病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述25μL LAMP反应体系中各成分的用量为：MgSO4：20nmol，dNTP：1.0nmol，10×buffer，FIP：5pmol，BIP：5pmol，F3：20pmol，B3：20pmol，甜菜碱：25μmol，Bst酶：9.6U。7.根据权利要求3-6所述的猪细小病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP检测试剂盒还包括：显色剂、阳性对照...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵凯，倪建平，李春华，赵笑，胡瑞丽，杜亚楠，赵庆，赵斌安，史斌，赵桓震，潘磊，范小瑞，赵本进，蒋风英，张春玲，
申请(专利权)人：上海佳牧生物制品有限公司，上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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