包含犬细小病毒遗传性变体的疫苗制造技术

提供了犬细小病毒疫苗和诊断以及其使用方法。所述疫苗有效抗新出现的占优势的犬细小病毒变体。

【技术实现步骤摘要】
本申请是国际申请日为2008年6月12日、国际申请号为PCT/US2008/066720、进入国家阶段的申请号为200880103009.8、专利技术名称为“包含犬细小病毒遗传性变体的疫苗”的PCT申请的分案申请。序列表本申请包括2008年6月12日创建的伴随文本文件“Sequence.txt”的完整内容作为序列表，所述文本文件包含3,780字节，在此通过引用并入本文。说明书专利技术背景
总的来说，本专利技术涉及改善的犬细小病毒(CPV)疫苗制剂和诊断测试。特别地，本专利技术提供了改善的CPV疫苗制剂和诊断测试，其包括在犬群体中目前循环的新出现的占优势CPV变体。
技术介绍
犬细小病毒(CPV)主要是感染犬特别是幼年犬的肠病原体。细小病毒感染的特征在于超过4-5周龄的犬和幼犬中的急性腹泻、发热和白细胞减少症，以及更年幼的幼犬中的心肌病。来自未接种犬的疾病死亡率极高。尽管针对CPV的疫苗是可获得的，但CPV是单链RNA病毒且具有极度的突变能力，所以病毒显示在抗原上改变的显著能力，并且从而逃避由疫苗提供的免疫保护。因此，抗原型和致病剂的基因型的持续监控是必要的。CPV首先在1978年分离，并且命名为“CPV-2”，以使其与细小病毒-犬细小病毒(CMV或CPV-I)区分。CPV-2一般被认为是猫传染性粒细胞缺乏症病毒(FPV)或貂肠病毒(MEV)的遗传性变体，并且在遗传和抗原上与感染貂、狐狸、浣熊和其他肉食动物的细小病毒非常紧密相关。CPV衣壳包含仅具有两个可读框的约5200个碱基的单链DNA基因组，但由于可变mRNA剪接而编码至少4种蛋白质。细小病毒衣壳由两种病毒蛋白质(VP)——VP1和VP2组成，其中VP2是主要免疫原性细小病毒衣壳蛋白质。原始CPV分离物的遗传性变体在1979-1980年鉴定，并且命名为CPV 2a型。在二十世纪八十年代中期，鉴定了另一种变体，2b型，并且自那以后，2a和2b型看起来已完全取代原始CPV-2。目前疫苗仅针对2a和2b变体，尽管2a变体在美国已不再检测出。对于CPV发现和进化的综述，参见Parrish和Kawaoka，2005。CPV-2b仅在两个氨基酸位置处不同于CPV-2a：2a中的Asn-426(由AAT编码)是2b中的Asp(由GAT编码)，并且2a中的Ile-555是2b中的Val。Ile-555至Val的改变实际上是至原始2型序列的逆转。CPV-2a和2b抗原型看起来在多年中是相对稳定的。然而，在2000年，描述了变体“2c”，其中位置426是由GAA编码的Glu(位置555仍是Val)。2c变体已在意大利(Buonavoglia等人，2001)、越南(Nakamura等人，2001)和其他国家包括西班牙(Nakamura等人，2004；Decaro等人，2006)得到报告，但到目前为止不存在2c变体在美国证实的报告，并且CPV疫苗仍未更新以包括此种变体。这是特别重要的，因为与主要感染幼犬的先前描述的变体不同，CPV2c具有感染成年犬的能力。此外，在位置494和572处具有密码子变异的2b变体序列在2003年提交给GenBank(gi：54646340)，并且由Shackelton等人在2005年报告(Proceedings National Academy Sciences 102：379-384)，但未基于此种序列提出在CPV疫苗或诊断组合物中的改变。当疫苗未更新时，出现几个问题。首先，即使接种过的犬也可能对疫苗中未包括的CPV变体引起的感染易感。其次，当接种过的犬生病时，它们的主人经常声称疫苗中的病毒株引起疾病。这通常导致对物主支付赔偿，因为疫苗公司没有切实的途径来提供相反的证据。已提出几种CPV疫苗制剂：Appel等人的美国专利4,193,990和4,193,991分别描述了异型和灭活(“杀死的”)病毒疫苗，其中示例性疫苗提供抗原始CPV的保护。Carmichael等人的美国专利4,303,645描述了包含由非肿瘤形成细胞系中病毒延长的连续传代产生的减毒CPV的疫苗。示例性疫苗还提供抗原始CPV分离物的保护。Wood等人的美国专利4,971,793和Valdes等人的美国专利5,882,652都描述了重组亚单位疫苗，其包括在重组杆状病毒中产生的CPV VP-2蛋白质。VP-2蛋白质无特定类型或亚型。Parrish等人的美国专利5,885,585描述了包含减毒形式的2b变体的CPV疫苗。由于CPV病毒突变且发展新抗原性变体的能力，存在监控CPV变体的基因构成且开发反映目前CPV变体的疫苗和诊断测试的迫切需要。
技术实现思路
本专利技术提供了用于预防CPV感染的更新疫苗，以及用于检测新的和正在出现的CPV变体的诊断方法。疫苗和诊断方法基于先前未知和先前未被了解的CPV变体的发现，并且考虑先前疫苗制剂和诊断对于其不足够的突变形式病毒的出现。本专利技术的疫苗提供抗新出现形式的CPV的保护作用，并且诊断提供了检测新进化形式的病毒的能力，这两种能力先前都无法获得。特别地，一种新的罕见变体可用作疫苗中的“标记”变体。标记变体的使用使得能够进行以下法医学研究，即，用标记变体接种的动物中的疾病症状是由疫苗还是由另一株CPV病毒引起的。新疫苗制剂包括具有单链DNA的完整减毒CPV，其具有一种或多种下述特征：2bΔ494Δ572是包含至少一种下述改变的2b CPV变体：编码VP2蛋白质位置494的密码子是TGC而不是TGT，并且编码VP2蛋白质位置572的密码子是GTC而不是GTA。这些改变不导致氨基酸改变(TGC和TGT都编码半胱氨酸，并且GTC和GTA都编码缬氨酸)。然而，这种变体在先前已用常规、目前可获得的疫苗接种过的动物中引起疾病，并且应掺入新疫苗制剂。尽管先前已描述了在位置494和572处的改变，但它们未被理解。此外，这种美国分离物可能包含其他突变。2bΔ431是新发现的罕见2b CPV变体(例如，2bΔ494Δ572的变体)，其中编码VP2蛋白质的位置431的密码子是CTG而不是CTA。尽管这个改变不导致氨基酸改变，但这种变体仍在接种过的动物中引起疾病，并且可以掺入新疫苗制剂内。明显地，由于它的缺乏，2bΔ431代表理想的疫苗“标记”序列。美国(Amrican)(或美国(United States))2c是在美国分离的第一种2c变体，并且是占优势的(81％)2c变体。这种变体也称为“主要2c变体”。2cΔ440是新发现的2c CPV变体，其中编码VP2蛋白质的位置440的密码子是GCA而不是ACA，这导致在这个位置处氨基酸序列从苏氨酸(ACA)到丙氨酸(GCA)的改变。这种变体引起接种过的动物中的疾病，并且应掺入新疫苗制剂内。这种变体目前是次要(19％)变体，并且在本文中也称为“次要2c变体”。2cΔ430Δ440，即2cΔ440的进一步变体，除在位置440的密码子处包含GCA外，其也通过在位置430处具有由TTA而不是常见TTG编码的亮氨酸而由已知2c序列改变。所有这些CPV变体通过聚合酶链反应(PCR)检测出，并且在来自受CPV感染的犬和/或其幼犬的细胞培养物中分离，所述犬已使用常规商业疫苗进行了抗CPV接种。因此，这些新出现变体能够在根据目前方案接种的犬中逃避免本文档来自技高网...

【技术保护点】
组合物，其包含核酸，所述核酸包含为SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
2007.06.14 US 60/943947;2008.02.11 US 61/0276181.组合物，其包含核酸，所述核酸包含为SEQ ID NO：2的核苷酸序列。2.权利要求1的组合物，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO: 2。3.用于检测驯养犬和幼犬、野生犬科动物、狼、野生犬、驯养猫和小猫、野生猫、貂、小熊猫、狐狸、狮子、老虎、动物园或保护区中的动物和研究机构中的动物中的细小病毒的诊断试剂盒，其包含对于在驯养犬和幼犬、野生犬科动物、狼、野生犬、驯养猫和小猫、野生猫、貂、小熊猫、狐狸、狮子、老虎、动物园或保护区中的动物和研究机构中的动物中检测选自下组的核酸序列特异的可杂交核酸：SEQ ID NO：2，其中核苷酸16-18是CTG以编码VP-2蛋白的位置431的Leu；SEQ ID NOS: 2...

【专利技术属性】
技术研发人员：S卡皮尔，E库珀，
申请(专利权)人：俄克拉荷马州大学评议会，
类型：发明
国别省市：美国;US