本发明专利技术公开了一种猪细小病毒VP2蛋白的编码基因、原核表达VP2蛋白病毒样颗粒的方法及其在疫苗制备中的应用。对序列进行优化，人工合成VP2基因，将合成的基因插入pET28a载体，然后和伴侣蛋白质粒共转入BL21(DE3)宿主菌中，使VP2蛋白和伴侣蛋白共表达，以促进VP2蛋白的正确折叠。实验证明，通过该重组菌表达的VP2蛋白能在体外实现自组装，且具有良好的免疫原性。使用由本发明专利技术表达的VP2蛋白制备的病毒样颗粒亚单位疫苗免疫小鼠和豚鼠能够诱导高水平的血凝抑制抗体和中和抗体产生，而且此疫苗能够预防豚鼠免受猪细小病毒强毒的感染。采用本发明专利技术的重组菌能够高效制备猪细小病毒病毒样颗粒，生产成本低、操作简单、具有更好的生物安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种猪细小病毒VP2蛋白可溶性表达的方法、编码基因，还涉及一种猪细小病毒病毒样颗粒的制备方法，以及该病毒样颗粒作为亚单位疫苗的应用。
技术介绍
猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV）是引起猪繁殖障碍的主要病因之一，其主要特征为引起初产母猪发生流产、死胎、木乃伊胎以及引起新生仔猪的死亡。自1966年Mayr和Mahnel发现和证实PPV存在及其致病性以来，国内外学者对其进行了广泛深入的研究。近年来，PPV感染呈扩大上升趋势，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。在我国，潘雪珠于1983年首次分离到了PPV。此后，在各地陆续分离到了数株PPV，虽然不同分离株均属于同一血清型，但可以引起多种临床症状，且都以造成繁殖障碍为主。另外，猪细小病毒经常与其它一些病毒，例如猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸系统综合征病毒等混合感染，导致断奶仔猪多系统综合征、皮炎、呼吸道综合征等。目前，我国经产母猪及种公猪PPV阳性率高达80%以上。PPV属于细小病毒科，细小病毒属，PPV的基因组为单股负链DNA，共编码3种结构蛋白：VP1、VP2和VP3，3种非结构蛋白：NS1、NS2和NS3。其中的VP2蛋白是该病毒主要的衣壳蛋白，具有自我组装为病毒样颗粒（virus-like particle, VLP）的能力，是良好的抗原转运载体，同时也有很好的免疫原性，可有效诱导动物机体产生免疫反应。许多研究和临床实践表明疫苗免疫是控制PPV流行的一个非常有效的方法，猪体免疫后主要通过体液免疫反应来抵抗PPV感染。我国用于预防PPV的疫苗主要为灭活疫苗，PPV灭活疫苗虽然可以有效的保护猪体免受PPV的感染，但存在生产成本高、病毒灭活不完全、且免疫效果不稳定等缺点；另外，灭活剂和残留病毒DNA可能对免疫猪体存在危险性。目前，新型PPV病毒样颗粒亚单位疫苗获得了广泛的研究，由VP2蛋白形成的病毒样颗粒具有与PPV病毒粒子相似的结构，且不含有病毒的遗传物质，不能自主复制、没有感染性，能以天然构象和模式递呈抗原，有效刺激体液和细胞免疫，诱导猪体产生良好的免疫反应。目前，研究报道的用于表达PPV病毒样颗粒的主要是昆虫细胞表达系统，但其生产成本较高。相比之下，原核表达系统蛋白表达量高、生产成本低，生产操作简单，但在实际操作中，多数蛋白由于不能正确折叠而形成包涵体，为后续的研究工作及应用带来障碍。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种人工修饰合成的猪细小病毒VP2基因的DNA序列，如SEQ ID NO.1所示。本专利技术的目的之二是提供一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组载体，将该重组载体导入大肠杆菌后，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白在体外可自我组装，并具有类似于天然病毒的血凝性。本专利技术的目的之三是提供一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，该重组菌含有VP2重组质粒和伴侣蛋白质粒，能够可溶性表达VP2蛋白，该VP2蛋白具有血凝性和优异的抗原性，可以用于制备猪细小病毒疫苗。本专利技术的目的之四是提供一种利用大肠杆菌可溶性表达猪细小病毒VP2蛋白的方法，该方法生产成本低，简单易行，适合大规模生产。本专利技术的目的之五是提供一种猪细小病毒VP2蛋白在体外组装的条件，该条件下形成的病毒样颗粒具有类似于天然细小病毒的大小、形状和血凝性。本专利技术的目的之六是提供一种猪细小病毒VP2蛋白在制备亚单位疫苗中的应用，将该疫苗免疫动物后可诱导机体产生特异性免疫反应，具备抗PPV强毒的特性。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：设计一种表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌，通过以下主要步骤制备得到：（1）VP2基因的人工修饰合成参照猪细小病毒中国毒株的VP2基因序列（GenBank: AY583318），根据大肠杆菌密码子的偏爱性，人工合成完整的猪细小病毒 VP2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。（2）重组载体的构建合成猪细小病毒VP2基因后对其进行PCR扩增， 插入pET28a载体，将连接产物转化JM109细胞中，筛选卡那霉素抗性的单克隆，并对其进行PCR和酶切鉴定，获得重组pET28a-VP2载体。（3）重组菌的构建将pET28a-VP2载体转化入BL21(DE3)细胞中，筛选卡那霉素抗性的单克隆，并对其进行PCR鉴定，获得含有VP2表达载体的重组菌；然后（通过CaCl2-MgCl2方法）将该重组菌制成感受态，并将伴侣蛋白质粒转入，获得最终表达可溶性VP2蛋白的重组菌。VP2蛋白体外组装条件的确定：诱导表达的VP2蛋白经亲和层析纯化后，在4℃进行透析以除去咪唑进而组装，通过改变透析液的盐离子浓度，来摸索VP2蛋白在体外组装的最佳条件，透析后的蛋白通过电镜，动态光散射和血凝实验进行检测。上述猪细小病毒病毒样颗粒在制备亚单位疫苗中的应用，研究表明将该疫苗免疫动物后可诱导机体产生特异性的免疫反应，具有抗PPV强毒攻击的特性。具体方案详见具体实施方式。本专利技术的有益技术效果是：本专利技术首次提出采用伴侣蛋白和PPV VP2蛋白在大肠杆菌中共表达，所表达VP2蛋白的可溶性得到了明显提高，且该VP2蛋白能在适宜条件下自组装成VLP，用该VLP制成的疫苗免疫小鼠和豚鼠可诱导良好的特异性免疫反应，能用于生产预防猪细小病毒的疫苗。（1）本专利技术根据大肠杆菌密码子的偏爱性，并结合大量的实践研究，人工修饰合成了猪细小病毒VP2基因的DNA序列，应用该序列表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性。（2）本专利技术将猪细小病毒VP2基因插入pET28a载体，并与伴侣蛋白共表达，提高了可溶性VP2蛋白的表达量；所选择的该分子伴侣不仅可以防止蛋白质在折叠过程中形成聚集物或无活性结构，提高正确折叠率，而且还可能影响折叠路径。（3）本专利技术所表达的猪细小病毒VP2基因可形成高质量的猪细小病毒病毒样颗粒。（4）本专利技术所表达的猪细小病毒病毒样颗粒制备亚单位疫苗，免疫动物后可诱导机体产生针对猪细小病毒的特异性免疫反应。附图说明图1：为pET28a载体图谱；pET28a载体由T7启动子启动，带有卡那霉素抗性基因。图2：为原核表达载体pET28a-VP2的酶切鉴定图谱；M：DL2000 DNA Marker；1&2：pET28a-VP2菌液PCR；3&4：pET28a-VP2双酶切。图3：为SDS-PAGE分析VP2蛋白表达的示意图；M：蛋白质marker；1：BL21(DE3)空菌诱导后；2：pET28a空载体诱导后；3：pET28a-VP2重组载体诱导后上清；4：pET28a-VP2重组载体诱导后沉淀；5：pET28a-VP2重组载体与伴侣蛋白共表达后上清；6：pET28a-VP2重组载体与伴侣蛋白共表达后沉淀。图4：为SDS-PAGE分析VP2蛋白纯化的示意图；M：蛋白质marker；1：BL21(DE3)空菌诱导后；2：pET28a空载体诱导后；3：pET28a-VP2重组载体与伴侣蛋白共表达后上清；4：pET28a-VP2重组载体与伴侣蛋白共表达后纯化产物。图5：为Western-blot分析VP2蛋白纯化的示意图；1：pET28a空载体诱导后；2：pET28a-VP2重组载体与伴侣蛋白共表达后上清；3：pET28a-VP2重组载体与伴侣蛋白共本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码猪细小病毒VP2蛋白的基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1. 一种编码猪细小病毒VP2蛋白的基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种表达载体，含有权利要求1所述的基因序列。3.一种宿主细胞，含有权利要求2所述的表达载体，以及可与该表达载体共表达的伴侣蛋白表达载体。4.如权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于：所述猪细小病毒VP2蛋白为可溶性表达。5.一种猪细小病毒VP2蛋白的可溶性表达方法，其特征在于：将猪细小病毒VP2蛋白与伴侣蛋白共同表达。6.如权利要求5所述猪细小病毒VP2蛋白的可溶性表达方法，其特征在于，具体包括以下步骤：A．设计并合成密码子优化的猪细小病毒VP2基因，与pET28a载体进行连接，构建原核表...
【专利技术属性】
技术研发人员：张改平，刘运超，王爱萍，陈玉梅，邢广旭，姬鹏超，刘文英，王娟，冯景，刘东民，邓瑞广，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，河南中泽生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41
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