一种用于大肠杆菌电泳样品制备的方法技术

本发明专利技术提供一种用于大肠杆菌电泳样品制备的新的方法，对于高密度发酵培养的大肠杆菌发酵液，可以在处理样品时很好的实现大肠杆菌的裂解，有效降低粘度，确保样品移取的准确度，取得好的电泳检测结果。本发明专利技术制备的电泳通过考马斯亮蓝法染色和脱色，脱色结束后，将凝胶置于纯化水中，电泳条带清晰，色差明显，背景干净，无弥散带和杂带干扰。

Method for preparing Escherichia coli Electrophoresis Sample

The present invention provides a new method for Escherichia coli electrophoresis sample preparation, Escherichia coli fermentation for high density fermentation of Escherichia coli, can achieve very good cracking in the treatment sample, effectively reduce the viscosity of samples removed, ensure the accuracy achieved good results, electrophoresis. The prepared by electrophoresis and Coomassie brilliant blue staining after decolorization, decolorization, purification of water in the gel, electrophoresis bands were clear, clear color, clean background, no dispersion and mixed with interference.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供一种用于大肠杆菌电泳样品制备的新的方法，涉及生物样品制备

技术介绍
在大肠杆菌的生物反应器罐发酵培养中，有一种方式是高密度发酵，通过不断的添加补料和补充溶氧，大肠杆菌的生长可以长期保持在对数生长期，增殖的大肠杆菌的数量可以实现指数级的增长，大肠杆菌的浓度很高，发酵液的OD值可以在30--150。在发酵工艺的研究中，需要在不同的时间段抽取发酵液的样品进行电泳检测，分析大肠杆菌的生长状况和我们需要的目的蛋白的表达情况，以优化和建立大肠杆菌的发酵工艺。大肠杆菌蛋白电泳的常规方法是：将发酵液离心后，用50µL水重悬沉淀，加入50µL的凝胶加样缓冲液（含有50mmol/LTris.Cl，10mmol/LDTT，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油），100℃沸水中煮沸3-5min，离心后取上清液加入样品孔，进行电泳。对于高密度发酵的大肠杆菌发酵液样品，采用常规的处理方法和凝胶加样缓冲液，常常由于菌浓度太高，特别是发酵液的OD值超过40时，在沸水浴煮沸裂解菌体时，大量的菌体不能实现很好的裂解，释放的菌体内的蛋白、核酸和其他成分导致样品溶液的粘度很大，菌液粘在一起，离心后的上清液很少，难以用移液器准确的定量吸取。不仅在向样品孔中加样时增添了很大困难，而且不能保证加样量的准确度。电泳的结果很差，在凝胶上出现条带不清晰、背景不干净、产生弥散带的现象。对于应用生物反应器高密度发酵培养的大肠杆菌样品，本专利技术设计的蛋白电泳的样品制备方法，增加了样品处理的步骤，在凝胶加样缓冲液中增加了新的成分，包括：10-20%TritonX-100，10-20%异丙醇，10-15%山梨醇，有助于溶解大肠杆菌裂解后释放出的脂类物质等粘性物质，以解决制备的样品粘度大，难以移取的问题。在样品煮沸裂解、离心后，收获的上清液的澄清度很高，保证了加样量的准确度，取得了良好的电泳结果。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于大肠杆菌电泳样品制备的新的方法，达到取得理想的电泳分析、检测结果的目的，本专利技术提供的一种制备大肠杆菌发酵液的电泳样品的方法，包括以下步骤：1）对应用生物反应器高密度培养的大肠杆菌发酵液，取1mL大肠杆菌发酵液，在3台式离心机上1000rpm离心1分钟，弃去上清液收获沉淀，加入1mLPBS缓冲液（重悬沉淀，1000rpm离心1min，弃去上清液收获沉淀；加入1mL洗涤液重悬沉淀，37℃下静置孵育10min，1000rpm离心1min，弃去上清液收获沉淀；向沉淀中加入200µLH2O重悬沉淀，加入凝胶加样缓冲液200µL，100℃沸水中煮沸5-10min，1000rpm离心1min，弃去沉淀收获上清液，从上清液中取10µL上样，进行电泳；2）在常规的电泳条件下，第一步在恒压80V下，电泳30min，第二步在恒压120V下，电泳120min，结束电泳，即得目标产物。本专利技术所述的PBS缓冲液由20mM磷酸氢二钠、20mM磷酸二氢钠、145mMNaCl制成，pH7.4。本专利技术所述洗涤液由0.5M尿素、10%TritonX-100、50mmol/LTris.Cl制成，pH6.8。本专利技术所述的凝胶加样缓冲液由10-20%TritonX-100、10-20%异丙醇、10-15%山梨醇、50mmol/LTris.Cl、10mmol/LDTT、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油混合而成。本专利技术的积极效果在于：对于高密度发酵培养的大肠杆菌发酵液，可以在处理样品时很好的实现大肠杆菌的裂解，有效降低粘度，确保样品移取的准确度，取得好的电泳检测结果。本专利技术制备的电泳通过考马斯亮蓝法染色和脱色，脱色结束后，将凝胶置于纯化水中，电泳条带清晰，色差明显，背景干净，无弥散带和杂带干扰。附图说明图1.实施例1的大肠杆菌发酵液的电泳结果图；图2.实施例2的大肠杆菌发酵液的电泳结果图；图3.实施例3的大肠杆菌发酵液的电泳结果图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本专利技术的阐释而非对本专利技术的任何形式的限制。实施例11）对应用生物反应器高密度培养的大肠杆菌发酵液，取1mL大肠杆菌发酵液，在3台式离心机上1000rpm离心1min，弃去上清液收获沉淀，加入1mLPBS缓冲液（含20mM磷酸氢二钠，20mM磷酸二氢钠，145mMNaCl，pH7.4）重悬沉淀，1000rpm离心1min，弃去上清液收获沉淀。加入1mL洗涤液（含有0.5M尿素，10%TritonX-100，50mmol/LTris.Cl，pH6.8）重悬沉淀，37℃下静置孵育10min，1000rpm离心1min，弃去上清液收获沉淀。向沉淀中加入200µLH2O重悬沉淀，加入凝胶加样缓冲液（含有10%TritonX-100，10%异丙醇，10%山梨醇，50mmol/LTris.Cl，10mmol/LDTT，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油）200µL，100℃沸水中煮沸5min，1000rpm离心1min，弃去沉淀收获上清液，从上清液中取10µL上样，进行电泳；2）在常规的电泳条件下，第一步在恒压80V下，电泳30min，第二步在恒压120V下，电泳120min，结束电泳，即得目标产物。电泳结束后通过考马斯亮蓝法染色和脱色，脱色结束后，将凝胶置于纯化水中，电泳条带清晰，色差明显，背景干净，无弥散带和杂带干扰。电泳结果见附图1。实施例21）对应用生物反应器高密度培养的大肠杆菌发酵液，取1mL大肠杆菌发酵液，在3台式离心机上1000rpm离心1min，弃去上清液收获沉淀，加入1mLPBS缓冲液（含20mM磷酸氢二钠，20mM磷酸二氢钠，145mMNaCl，pH7.4）重悬沉淀，1000rpm离心1min，弃去上清液收获沉淀。加入1mL洗涤液（含有0.5M尿素，10%TritonX-100，50mmol/LTris.Cl，pH6.8）重悬沉淀，37℃下静置孵育10min，1000rpm离心1min，弃去上清液收获沉淀。向沉淀中加入200µLH2O重悬沉淀，加入凝胶加样缓冲液（含有20%TritonX-100，20%异丙醇，15%山梨醇，50mmol/LTris.Cl，10mmol/LDTT，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油）200µL，100℃沸水中煮沸10min，1000rpm离心1min，弃去沉淀收获上清液，从上清液中取10µL上样，进行电泳；2）在常规的电泳条件下，第一步在恒压80V下，电泳30min，第二步在恒压120V下，电泳120min，结束电泳，即得目标产物。电泳结束后通过考马斯亮蓝法染色和脱色，脱色结束后，将凝胶置于纯化水中，电泳条带清晰，色差明显，背景干净，无弥散带和杂带干扰。电泳结果见附图2。实施例31）对应用生物反应器高密度培养的大肠杆菌发酵液，取1mL大肠杆菌发酵液，在3台式离心机上1000rpm离心1min，弃去上清液收获沉淀，加入1mLPBS缓冲液（含20mM磷酸氢二钠，20mM磷酸二氢钠，145mMNaCl，pH7.4）重悬沉淀，1000rpm离心1min，弃去上清液收获沉淀。加入1mL洗涤液（含有0.5M尿素，10%TritonX-100，50mmol/LTris.Cl，pH6.8）重悬沉淀，3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备大肠杆菌发酵液的电泳样品的方法，包括以下步骤：1）对应用生物反应器高密度培养的大肠杆菌发酵液，取1mL大肠杆菌发酵液，在3台式离心机上1000rpm离心1分钟，弃去上清液收获沉淀，加入1mLPBS缓冲液（重悬沉淀，1000rpm离心1 min，弃去上清液收获沉淀；加入1mL凝胶加样缓冲液重悬沉淀，37℃下静置孵育10min，1000rpm离心1 min，弃去上清液收获沉淀；向沉淀中加入200µL H2O重悬沉淀，加入洗涤液200µL，100℃沸水中煮沸5‑10min，1000rpm离心1 min，弃去沉淀收获上清液，从上清液中取10µL上样，进行电泳；2）在常规的电泳条件下，第一步在恒压80V下，电泳30min，第二步在恒压120V下，电泳120min，结束电泳，即得目标产物。

【技术特征摘要】
1.一种制备大肠杆菌发酵液的电泳样品的方法，包括以下步骤：1）对应用生物反应器高密度培养的大肠杆菌发酵液，取1mL大肠杆菌发酵液，在3台式离心机上1000rpm离心1分钟，弃去上清液收获沉淀，加入1mLPBS缓冲液（重悬沉淀，1000rpm离心1min，弃去上清液收获沉淀；加入1mL凝胶加样缓冲液重悬沉淀，37℃下静置孵育10min，1000rpm离心1min，弃去上清液收获沉淀；向沉淀中加入200µLH2O重悬沉淀，加入洗涤液200µL，100℃沸水中煮沸5-10min，1000rpm离心1min，弃去沉淀收获上清液，从上清液中取10µL上样，进行电泳；2）在常规的电泳条件下，第一步在恒压80V下，电泳30min，第二步在恒压120V下，电泳120m...

【专利技术属性】
技术研发人员：王群，邰建东，薛曌萍，刘昶，王超，李强，李莹，王欣，王玉莹，吕品，王美华，
申请(专利权)人：长春长生生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22