一种短稳杆菌农药的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种短稳杆菌农药的制备方法，属于微生物技术领域。本发明专利技术制得的短稳杆菌农药喷施于植物表皮后，短稳杆菌GXW15‑4经口吸进入植物害虫体内，24小时内导致植物鳞翅目害虫病变死亡。使用安全，对环境无污染，对植物本身、对害虫天敌、对哺乳动物以及水生动物无毒害作用。

【技术实现步骤摘要】
本申请为短稳杆菌农药及其制造方法的分案申请，原申请的申请日：2011年8月9日，申请号：201110234995.4，名称：短稳杆菌农药及其制造方法。
本专利技术涉及一种短稳杆菌农药的制备方法，属于微生物

技术介绍
多种植物的主要害虫是鳞翅目害虫，例如菜青虫、小菜蛾、斜纹夜蛾、水稻纵卷叶虫、大螟、二化螟、三化螟、棉蛉虫、果树刺蛾。对植物施用农药是防治植物害虫的主要措施。随着社会的发展和人类的进步，人们对农产品化学污染越来越担忧，迫切期望以生物农药替代化学农药。为此，国际上很多发达国家投入相当大的人力、财力发展生物农药，但生物杀菌剂产品开发的较多，生物杀虫剂产品开发进展不快。就对化学农药抗药性较强的小菜蛾、斜纹夜蛾、水稻纵卷叶螟等重大鳞翅目害虫的生物农药开发应用而言，国内外市场上主要产品仍然是德国人贝尔奈(Berliner)于100年前发现并研究制造成功的苏云金杆菌杀虫剂(BT)，目前为止尚未有其他更好的替代产品，更未有用短稳杆菌GXW15－4制造杀虫剂的先例。需要指出的是：近年来，国内外农药市场上出现了一些植物源杀虫剂品种，但因植物源杀虫剂受植物品种和资源限制，产业化生产难度较大，且因植物源杀虫剂开发成本普遍较高，农户选择使用植物源杀虫剂的积极性不高。
技术实现思路
本专利技术是针对植物重大害虫对化学农药产生一定抗药性以及人们对使用化学农药普遍担忧的现状，提出一种短稳杆菌农药的制备方法。利用生物发酵技术所制得的农药使用安全，对环境无污染，对植物本身、对害虫天敌、对哺乳动物以及水生动物都无毒害作用。本专利技术通过以下技术方案解决技术问题：一种短稳杆菌农药的制备方法，包括以下步骤：步骤一、解剖罹病死亡的害虫尸体，分离、提取短稳杆菌GXW15-4菌株；步骤二、将分离、提取出的菌株用试管LB斜面培养24～36小时，温度24～30℃，光照3000～5000Lx，PH值7～7.2；步骤三、将培养出的短稳杆菌GXW15-4接种到大田作物上的斜纹夜蛾高龄幼虫体内进行野外驯化，再从死亡速度快的斜纹夜蛾高龄幼虫尸体中筛选短稳杆菌GXW15-4优良菌株，接种到菌种培养瓶中，用摇床培养法进行一级发酵，发酵条件与步骤二相同；步骤四、用容积梯度为10倍的三级发酵装置发酵，加适量水和短稳杆菌GXW15-4原种，搅拌成混合液，培养条件与步骤二相同，形成短稳杆菌悬浮液，经瓶装形成短稳杆菌悬浮剂产品。将所述短稳杆菌悬浮液直接稀释成1-1.3亿孢子/ml含量的溶液用于植物鳞翅目害虫的防治。所述悬浮液为含有大于等于100亿孢子/ml短稳杆菌GXW15-4活体的乳白色悬浮液。以上方法的所述步骤四中发酵的培养基质采用灭菌后的大豆粉或者豆奶粉4.5％、蚕蛹粉3％、钙粉1％、食盐0.5％。本专利技术进一步提供短稳杆菌母药的制备方法，在上述方法的基础上，还包括以下步骤，步骤五、将短稳杆菌悬浮液制造过程中的一级发酵产物或者二级发酵产物放置高速离心机中进行先期脱水处理；步骤六、将高速离心脱水处理后的产物用三级冷冻干燥机进行干燥处理，温度分别控制在-5℃、-15℃、-75℃，使其成为含水量小于5％的粉剂，包装形成短稳杆菌母药。将所述短稳杆菌母药直接稀释成1-1.3亿孢子/ml含量的溶液用于植物害虫防治，也可经深加工形成短稳杆菌农药其他剂型，还可与化学农药复配后用于兼治植物其他病虫害。所述短稳杆菌母药为具有大于等于300亿孢子/mg短稳杆菌GXW15-4活体的淡黄色粉末。短稳杆菌（Empedobacterbrevis）GXW15-4是镇江市润宇生物科技开发有限公司高级农艺师高小文于2001年9月解剖罹病死亡的斜纹夜蛾尸体发现的一种植物害虫病原菌。该菌于2002年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号CCTCCNO：M202046，保藏地址中国武汉武汉大学。短稳杆菌GXW15-4个体形态特征为：菌体呈短杆状，长2.6-3.8μm，宽0.8-1.1μm，两端钝圆，用扫描电镜观察其内部有约1μm3的正方晶体状。依据中国科学院微生物研究所检测鉴定报告([2009]微检字第175号)，短稳杆菌GXW15-4理化试验结果见表1：表1短稳杆菌农药理化试验结果(BIOLIGGN2)表短稳杆菌GXW15-4再生能力强，可在工厂化条件下大量繁殖，其繁殖基质主要采用灭菌后的大豆粉、豆奶粉、蚕蛹粉等，主要基质原料是可再生资源，且国内外市场上货源丰富，完成可以满足产业化生产的需要。本专利技术制得的短稳杆菌农药喷施于植物表皮后，短稳杆菌GXW15-4经口吸进入植物害虫体内，24小时内导致植物鳞翅目害虫病变死亡。使用安全，对环境无污染，对植物本身、对害虫天敌、对哺乳动物以及水生动物无毒害作用。本专利技术选用微生物发酵工艺制造短稳杆菌悬浮剂、选用微生物发酵、脱水工艺制造短稳杆菌母药，使用安全，对环境无污染，对植物本身、对害虫天敌、对哺乳动物以及水生动物都无毒害作用。附图说明图1为本专利技术方法的流程示意图。具体实施方式实施例本实施例包含了悬浮剂和母药的制备方法，如图1所示，具体如下：1、短稳杆菌农药制造方法短稳杆菌GXW15-4可采用微生物三级发酵技术大量繁殖。短稳杆菌GXW15-4发酵产物可直接包装成短稳杆菌悬浮剂，其制造步骤为：(1)解剖罹病死亡的植物害虫尸体，分离、提取短稳杆菌GXW15-4菌株。(2)将分离、提取出来的菌株用试管LB斜面培养24～36小时，温度24～30℃，光照3000～5000Lx，PH值7～7.2。(3)选出试管LB斜面活力强的优良菌株，用摇床培养法扩大培养，培养条件与步骤(2)相同。(4)用容积梯度为10倍的三级发酵装置发酵，采用灭菌后的大豆粉(或者豆奶粉)4.5％、蚕蛹粉3％、钙粉1％、食盐0.5％等作为培养基质，加适量水和短稳杆菌GXW15-4原种，搅拌成混合液，培养条件与步骤(2)相同，形成短稳杆菌悬浮液，经瓶装即为短稳杆菌悬浮剂产品。短稳杆菌母药是用短稳杆菌GXW15-4一级发酵产物或者二级发酵产物经高速离心脱水、三级冷冻干燥形成的粉状产物，其制造步骤为：(1)将短稳杆菌悬浮液制造过程中的一级发酵产物或者二级发酵产物放置高速离心机中进行先期脱水处理；(2)将高速离心脱水处理后的产物用三级冷冻干燥机进行干燥处理，温度分别控制在-5℃、-15℃、-75℃，使其成为含水量小于5％的粉剂，经气流粉碎后，包装形成短稳杆菌母药。短稳杆菌悬浮剂可直接稀释成1-1.3亿孢子/ml含量的水溶液均匀喷施于植物茎和叶片正反表皮，鳞翅目害虫经口吸进入体内后，24小时内便病变死亡。短稳杆菌母药可直接稀释成1-1.3亿孢子/ml含量的水溶液均匀喷施于植物茎和叶片正反表皮用于对植物鳞翅目害虫的防治。短稳杆菌母药也可深加工形成其他剂型的短稳杆菌农药用于对鳞翅目害虫的防治，还可与化学农药复配后用于兼治植物其他病虫害。2、短稳杆菌农药杀虫效果经南京农业大学测定，短稳杆菌悬浮剂对小菜蛾幼虫有明显的杀虫活性。经环境保护部南京环境科学研究所试验，短稳杆菌悬浮剂田间正常使用对斑马鱼、大型溞、小球藻、蜜蜂、鹌鹑均为低风险。经江苏省疾病预防控制中心检验，短稳杆菌悬浮剂对雌雄大鼠属微毒级，对家兔皮肤无刺激性，属弱致敏物。经中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所检验，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种短稳杆菌农药的制备方法，包括以下步骤：步骤一、解剖罹病死亡的害虫尸体，分离、提取短稳杆菌GXW15‑4菌株；步骤二、将分离、提取出的菌株用试管LB斜面培养24～36小时，温度24～30℃，光照3000～5000Lx，PH值7～7.2；步骤三、将培养出的短稳杆菌GXW15‑4接种到大田作物上的斜纹夜蛾高龄幼虫体内进行野外驯化，再从死亡速度快的斜纹夜蛾高龄幼虫尸体中筛选短稳杆菌GXW15‑4优良菌株，接种到菌种培养瓶中，用摇床培养法进行一级发酵，发酵条件与步骤二相同；步骤四、用容积梯度为10倍的三级发酵装置发酵，加适量水和短稳杆菌GXW15‑4原种，搅拌成混合液，培养条件与步骤二相同，形成短稳杆菌悬浮液，经瓶装形成短稳杆菌悬浮剂产品。

【技术特征摘要】
1.一种短稳杆菌农药的制备方法，包括以下步骤：步骤一、解剖罹病死亡的害虫尸体，分离、提取短稳杆菌GXW15-4菌株；步骤二、将分离、提取出的菌株用试管LB斜面培养24～36小时，温度24～30℃，光照3000～5000Lx，PH值7～7.2；步骤三、将培养出的短稳杆菌GXW15-4接种到大田作物上的斜纹夜蛾高龄幼虫体内进行野外驯化，再从死亡速度快的斜纹夜蛾高龄幼虫尸体中筛选短稳杆菌GXW15-4优良菌株，接种到菌种培养瓶中，用摇床培养法进行一级发酵，发酵条件与步骤二相同；步骤四、用容积梯度为10倍的三级发酵装置发酵，加适量水和短稳杆菌GXW15-4原种，搅拌成混合液，培养条件与步骤二相同，形成短稳杆菌悬浮液，经瓶装形成短稳杆菌悬浮剂产品。2.根据权利要求1所述短稳杆菌农药的制备方法，其特征在于：所述步骤四中发酵的培养基质采用灭菌后的大豆粉或者豆奶粉4.5％、蚕蛹粉3％、钙粉1％、食盐0.5％。3.根据权利要求1所述短稳杆菌农药的制备方法，其特征在于：还包括以下步骤，步骤五、将短稳杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：高小文，
申请(专利权)人：镇江市润宇生物科技开发有限公司，高小文，吴铭忻，
类型：发明
国别省市：江苏;32