一种高密度培养粪产碱杆菌及其制备方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种高密度培养粪产碱杆菌及其制备方法及用途，所述制备方法以生物碳作为吸附载体，例如木屑、动物骨头、植物根茎等生物碳，以粪产碱杆菌为出发菌株，是任意一种粪产碱杆菌菌种，依次经过如下步骤：步骤(1)试管扩大培养；(2)液体摇瓶培养；(3)种子罐扩大培养、(4)发酵培养、(5)干燥。本发明专利技术所述的方法制得的粪产碱杆菌菌体密度达到5×1013～1×1015cfu/mL。本发明专利技术把生物吸附与液态发酵有机结合，提高了液体发酵的菌体密度，在不添加任何设备和不使用连续培养和半连续培养实现了粪产碱杆菌的高密度培养，且本发明专利技术所培养的粪产碱杆菌可用作生物肥料的活菌剂或与其他菌种共同作为生物肥料的活菌剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种高密度培养粪产碱杆菌及其制备方法及用途。
技术介绍
所谓生物碳，是由有机垃圾，如动物粪便，动物骨头，植物根茎，木屑和麦秸秆等生物量经过热化学效应，被高温分解，成为可用做肥料的类似于碳球状的物质。其中由植物形成的，以固定碳元素为目的的木炭被称为“生物碳”。土地中自然存在大量的碳元素，但是这些碳是不稳定的，受气候影响会释放二氧化碳。而生物碳则可以固定碳元素长达几百年。生活在巴西亚马逊河流域的人们长期使用一种特殊的肥料。这种肥料来源于当地，具有极强的恢复贫瘠土壤肥力的能力。当地人把它称为“印第安人的黑土壤”。它多产、肥沃，与当地稀疏、贫瘠的土壤形成鲜明的对比。现代研究证明，黑土壤是2500年，甚至6000年以前由生活在亚马逊流域的人们制造的。一般认为，他们使用的材料包括动物粪便，鱼，动物骨头和植物废物。但是生产黑土壤最关键的原料，也是黑土壤之所以呈现黑色的原因，是木炭的使用。黑土壤中的木炭可以使土壤肥力维持一个世纪之久。几个世纪以来，生活在南美亚马逊流域的人们都靠这些原生态材料制造“黑土壤”来肥沃土地。几千年过去了，那儿的土壤不需耕耘灌溉，依旧十分肥沃。佐治亚大学的科学家Steiner解释道：“千百年过去，这个区域依旧沃土依然，那是因为土壤中富含碳元素”。因此，生物碳使人们看到了无需砍伐森林也可开拓农耕地的希望。生物碳可以保护环境。鉴于其高含碳量和多孔的特性，它不仅可提高土壤蓄水储养的能力，还可保护土壤中的微生物。它像一个地下碳水槽，锁住二氧化碳，最终达到增加作物产量的效果。生物碳可吸收有机物质腐烂时释放至大气的二氧化碳；并帮助植物有效储存其光合作用所需的二氧化碳。通过这两种方式，生物碳起到了洁净空气的作用生物碳是面向未来的，低成本，可持续性的环保能源。而它的起源则可追溯到几千年前。由于在现代农业生产中大规模、广泛地使用化肥、农药，虽然获得产量上的大幅增长，却付出了产品品质下降、加剧环境污染的巨大代价。因此，坚持农业可持续发展战略，使用生物技术，尤其是微生物技术受到日益广泛的关注。粪产碱菌是一种具有多种变异性的菌体，培养试管斜面菌种一般采用的是营养琼脂培养基；其菌体带有基因可制造一些酵素，所以它在生物工程中应用很广范。此菌中的许多种类可产生一些非天然的胺基酸，故在制药工业上应用也很广范。有些种类被发现具有分解作为杀虫剂或除草剂的二氯苯氧基乙酸的能力。另外，粪产碱菌可以应用于废水处理中的活性污泥法中，利用该菌分解废水中有机物。现代研究表明粪产碱菌具有固氮、分泌吲哚乙酸、赤霉素等多种植物激素的功能，有十分明显的促进植物生长的作用。近十几年来，科研人员对粪产碱菌的生理生化特征、固氮酶结构和功能特定、氮元素代谢途径和代谢机理方面做了大量的研究。研究发现，该细菌不但能入侵到水稻根部内实施固氮作用，还能在高铵盐存在的条件下合成铁蛋白及钼铁蛋白。李法峰等从突变库中筛选出了一株色氨酸营养缺陷型的粪产碱菌突变株，通过研究表明粪产碱菌的吲哚乙酸合成需要外源色氨酸的参与。
技术实现思路
1、要解决的技术问题现有高密度培养技术通常是通过外加设备，通过截留或连续培养获得，这些技术不仅易污染，而且菌体浓度不高。针对现有技术这些问题，本专利技术提供一种利用生物碳吸附，无需外加设备，而且可以实现分批高密度培养的方法，通过该方法培养硅酸盐菌体密度可以达到1×1013～1×1015cfu/mL。2、技术方案为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种高密度培养粪产碱杆菌及其制备方法及用途，所述制备方法以生物碳作为吸附载体，以粪产碱杆菌为出发菌株，依次经过试管斜面培养、液体摇瓶培养、种子罐扩大培养、液体发酵培养、喷雾干燥和包装工艺制备。对上述方案的进一步改进，所使用的生物碳是污泥、动物粪便、动物骨头、植物根茎和木屑中的任一种；所使用的是粪产碱杆菌菌种是任意一种粪产碱杆菌。本专利技术提供了一种高密度培养粪产碱杆菌的方法，其制备方法包括如下步骤：A1试管扩大培养：将粪产碱杆菌斜面菌种接种于粪产碱杆菌试管斜面培养基中进行培养，制得粪产碱杆菌试管斜面菌种；A2液体摇瓶培养：将步骤A1所制得的粪产碱杆菌试管斜面菌种接种到装有含所述生物碳的液体摇瓶培养基的摇瓶中，进行培养，制得粪产碱杆菌液体摇瓶菌种；A3种子罐扩大培养：将步骤A2所制得的粪产碱杆菌液体摇瓶菌种接种到含所述生物碳的种子罐培养基中进行培养，制成粪产碱杆菌菌种；A4液体发酵培养：将步骤A3所制得的粪产碱杆菌菌种接种到含所述生物碳的液体发酵培养基中，并混合均匀，进行发酵培养，制得粪产碱杆菌发酵液；A5包装：粪产碱杆菌发酵液经过离心、喷雾干燥、包装制得粪产碱杆菌干粉。对上述方案的进一步改进，所述制备方法具体如下：B1试管扩大培养：接种一环粪产碱杆菌斜面菌种到粪产碱杆菌试管斜面培养基中，25～40℃培养2～10天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；B2液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有20～150mL含所述生物碳的液体摇瓶培养基的三角瓶中，三角瓶在转速为10～160r/min，温度25～40℃的条件下，摇床培养18-86h，制成粪产碱杆菌液体摇瓶菌种；B3种子罐扩大培养：将步骤B2所制得的液体摇瓶菌种接种到含所述生物碳的种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为0.2～10％的接种量接种，在温度为25～40℃，搅拌转速为10～120r/min，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2～1.8:1的通气量条件下，培养18～96h，制成粪产碱杆菌菌种；B4液体发酵培养：将步骤B3所制得的粪产碱杆菌菌种按体积比为0.2～10％接种量接到含所述生物碳的液体发酵培养基中，在温度25～40℃，搅拌转速为10～120r/min，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2～1.8:1的通气量条件下，培养48～96小时，制得粪产碱杆菌发酵液，该发酵液菌体浓度为1013～1015cfu/mL；B5将步骤B4所制得的粪产碱杆菌发酵液4000～10000r/min离心10～30min，调节菌体浓度为1014～1016cfu/mL，进风温度110-120℃，进样速度600～800mL/h，雾化压力0.08～0.2MPa，热风流量20～40M3/h；在此条件下，喷雾干燥后产物活菌量达1015～1017cfu/g；对上述方案的进一步改进，所述步骤(2)中所述液体摇瓶培养基是在100～130℃条件下灭菌10～60min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有蔗糖5～20g，蛋白胨1～10g，麸皮2～20g，牛肉浸膏1～10g，生物碳3～30g。对上述方案的进一步改进，步骤B3中所述种子罐扩大培养基是在100～130℃条件下灭菌10～60min制得，且每升种子罐培养基中含有蔗糖5～20g，蛋白胨1～10g，麸皮2～20g，牛肉浸膏1～10g，生物碳3～30克。对上述方案的进一步改进，步骤B4中所述发酵培养基是在100～130℃条件下灭菌10～60min制得，且每升发酵培养基中含有蔗糖10～50g，蛋白胨1～10g，麸皮2～20g，酵母浸膏3～20，植物油2～8g，生物碳5～50g。本专利技术还提供了一种高密度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高密度培养粪产碱杆菌的方法，其特征在于：所述制备方法以生物碳作为吸附载体，以粪产碱杆菌作为出发菌株，依次经过试管斜面培养、液体摇瓶培养、种子罐扩大培养、液体发酵培养、喷雾干燥和包装工艺制备。

【技术特征摘要】
1.一种高密度培养粪产碱杆菌的方法，其特征在于：所述制备方法以生物碳作为吸附载体，以粪产碱杆菌作为出发菌株，依次经过试管斜面培养、液体摇瓶培养、种子罐扩大培养、液体发酵培养、喷雾干燥和包装工艺制备。2.根据权利要求1所述的一种高密度培养粪产碱杆菌的方法，其特征在于：所使用的生物碳是污泥、动物粪便、动物骨头、植物根茎和木屑中的任意一种；所使用的粪产碱杆菌菌种是任意一种粪产碱杆菌。3.根据权利要求1所述的一种高密度培养粪产碱杆菌的方法，其特征在于：其制备方法包括如下步骤：A1试管扩大培养：将粪产碱杆菌斜面菌种接种于粪产碱杆菌试管斜面培养基中进行培养，制得粪产碱杆菌试管斜面菌种；A2液体摇瓶培养：将步骤A1所制得的粪产碱杆菌试管斜面菌种接种到装有含所述生物碳的液体摇瓶培养基的摇瓶中，进行培养，制得粪产碱杆菌液体摇瓶菌种；A3种子罐扩大培养：将步骤A2所制得的粪产碱杆菌液体摇瓶菌种接种到含所述生物碳的种子罐培养基中进行培养，制成粪产碱杆菌菌种；A4液体发酵培养：将步骤A3所制得的粪产碱杆菌菌种接种到含所述生物碳的液体发酵培养基中，并混合均匀，进行发酵培养，制得粪产碱杆菌发酵液；A5包装：粪产碱杆菌发酵液经过离心、喷雾干燥、包装制得粪产碱杆菌干粉。4.根据权利要求3所述的一种高密度培养粪产碱杆菌的方法，其特征在于：所述制备方法具体如下：B1试管扩大培养：接种一环粪产碱杆菌斜面菌种到粪产碱杆菌试管斜面培养基中，25～40℃培养2～10天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；B2液体摇瓶培养：接种一环步骤B1所制得的试管斜面菌种接种于装有20～150mL含所述生物碳的液体摇瓶培养基的三角瓶中，三角瓶在转速为10～160r/min，温度25～40℃的条件下，摇床培养18-86h，制成粪产碱杆菌液体摇瓶菌种；B3种子罐扩大培养：将步骤B2所制得的液体摇瓶菌种接种到含所述生物碳的种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为0.2～10％的接种量接种，在温度为25～40℃，搅拌转速为10～120r/min，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2～1.8:1的通气量条...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞建国，
申请(专利权)人：河海科技工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32