采用补料分批发酵法制备高密度酪酸菌活菌制剂的方法技术

本发明专利技术公开了采用补料分批发酵法制备高密度酪酸菌活菌制剂的方法，该方法是由酪酸菌在酪酸菌种子培养基中经二级种子扩大培养和在酪酸菌发酵培养基中发酵，在发酵过程中通过补充碳源、氮源以及用氨水来调节发酵液的pH值等代谢调控措施，来增加酪酸菌的菌体数、芽孢体的转化率以及发酵罐装料系数，再经菌体收集、添加保护剂、喷雾干燥制粉、菌粉检验、包装工序制得;本发明专利技术方法生产周期短，酪酸菌的培养密度高，活菌数目较高，生产成本较低，能够大规模产业化生产，产品质量稳定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酪酸菌活菌制剂的制备方法，具体是。㈡
技术介绍
酪酸菌即丁酸梭菌((Clostridium butyrium)，为革兰阳性厌氧芽孢杆，是1933年由日本千叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告的，因此又名宫入菌。该菌存在于土壤、人和动物肠道、干酪及自然酸奶中，细菌学分类属于梭菌属，为革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，培养后期可变为阴性菌。酪酸菌为梭状芽孢杆菌，菌体为直或微弯，孢子圆形或椭圆形，为内生芽孢，常使菌体中部膨大呈梭形。对外界环境有较强的抵抗力，经80°C、30min和90°C、10min热处理后全部存活；加热90°C、20min后，95 %存活；加热100°C、5min后30 %存活。耐热、耐酸，pH值为1. 0 5. 0时仍能存活； PH值为4.0 9. 8时能适合其生长。因此，酪酸菌能够抵抗制粒过程中的高温、高热， 与目前广泛应用的非芽孢类活菌制剂相比，更具广阔的市场前景。酪酸菌是人体肠道内正常的有益菌，它能够拮抗有害菌，促进有益菌生长，调节人的肠道菌群平衡；能促进肠黏膜修复，维持屏障完整，并能祛除肠黏膜炎症，阻止肠黏膜腐烂，恢复肠功能；分泌低聚糖酶，把多糖降解为低聚糖，促进肠道内有益菌群(双歧杆菌、 乳酸杆菌等)的繁殖和成长，快速恢复菌群平衡；对有害菌具有拮抗作用。调节宿主的基因表达，有效防治肠癌；能恢复肠道的免疫功能及化学屏障、生物屏障，健康肠道，恢复肠功能。正是由于酪酸菌具有的独特的生物特点，早在上个时间四十年代，日本就已经把它开发成为治疗肠道疾病的药物。近半个世纪以来，日本的酪酸菌活菌制剂-米雅系列产品在日本、韩国、中国等亚洲国家和地区广泛应用于消化系统、小儿、外科、肿瘤、妇产科等种种原因肠道菌群失调、急慢性腹泻、抗生素相关肠炎、便秘等疾病的治疗，疗效确切。酪酸菌及其制剂主要应用于以下几个方面1、作为药物使用能够治疗肠菌群紊乱、腹泻、肠炎，预防肠癌。另外酪酸菌也可作为肠炎、肝病、化放疗造成的免疫力下降、菌群失调的良好辅助治疗药物；2、作为兽药使用酪酸菌可用以治疗动物肠道感染和肠功能异常。酪酸菌可增加动物肠内酪酸、醋酸等短链脂肪酸生成量，可促进排便，可抑制肠道腐败产物氨和胺类的产生；可抑制霍乱弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌、致病性大肠杆菌、出血性大肠杆菌以及引起伪膜性肠炎的魏氏梭菌的繁殖；3、用作饲料添加剂酪酸菌能单独作为饲料添加剂使用，也能与乳酸菌、芽孢菌、双歧杆菌等益生菌复配使用，能增强该类产品的功效。在提高动物免疫力、抗病力及降低猪的料肉比方面都有显著效果目前。近年来，我国生物制药方面有着飞速的发展，乳酸菌种、双岐杆菌等微生态制剂国内在人药制剂和兽药制剂领域都已实现产业化生产，人用酪酸菌活菌制剂目前国内也有多家制药企业在进行产业化生产。但总体来说，酪酸菌产业项目还存在着生产规模偏小，冷冻干燥菌粉活菌含量还不够高，芽孢形成率偏低，生产成本高，产品存放稳定性差等问题。酪酸菌微生态制剂的生产主要是利用其活的芽孢体，获得大量的酪酸菌芽孢体或活菌体并保持它们的活性是酪酸菌制剂生产的关键，芽孢数目越多越好。酪酸菌的生产方法都是采用液态深层发酵法培养酪酸菌菌体和芽孢，然后分离菌体及芽孢，并将其做成制剂。目前酪酸菌制剂比较流行的生产方法是采用各自取得的酪酸菌生产菌种，使用三级种子培养的方法，发酵培养酪酸菌活菌体，采用冻干机冷冻干燥的方法制备酪酸菌活菌制剂。 现有方法的主要不足是1.种子培养级数过多，总的发酵周期偏长，所需的设备多，加大了设备的投资和增加了染菌机会，加大了发酵风险；2.发酵罐装料系数为60-80%，设备利用率不高；3.发酵培养的酪酸菌菌落总数一般在1.0-5. 5 X IO8个/ml，芽孢率一般小于90%，酪酸菌的培养密度偏低，相应的发酵成本较大；4.发酵菌体分离技术采用的是管式离心机，单台管式离心机处理发酵液能力较小，目前国内最大规格的150型管式离心机发酵液处理能力为1.0 m3/h，大规模生产酪酸菌时受到设备限制；5.制剂技术均采用冷冻干燥技术，需要使用冻干机，由于冻干机的装料量有限，且设备投入大，使用成本高，限制了酪酸菌的大规模生产。曰
技术实现思路
本专利技术的目的主要是针对目前酪酸菌活菌制剂工艺所存在的问题， 提供一种，该方法生产周期短，酪酸菌的培养密度高，活菌数目较高，生产成本较低，能够大规模产业化生产，产品质量更稳定。本专利技术工艺方法的技术方案步骤如下①一级种子培养取酪酸菌种子冻干管菌种，接种于酪酸菌三角瓶一级种子培养基中，在34-38°C厌氧培养12 16h;所用培养基的原料及用量为葡萄糖0. 5%_2. 5 %、牛肉膏 0. 5% -2. 0%、酵母浸膏 0. 3% -0. 5%、磷酸氢二钾 0. 01% -0. 05%、氯化钠 0. 1%-0. 2 %、 水 94. 75-98. 59%,培养基的 pH 6. 0-7. 0 ；2)二级种子培养将一级种子接种于酪酸菌二级种子培养基中，接种量为酪酸菌二级种子培养基体积的3 9% ；在34-38°C厌氧培养12 16h;所用培养基的原料及用量为葡萄糖 1. 5%-2. 5 %、蛋白胨 1. 0% -1. 5%、酵母粉 0. 5% -1. 5%、磷酸氢二钾 0. 02% -0. 05%、氯化钠 0. 1%-0. 2 %、硫酸镁 0. 02%-0. 1%、水 94. 15-96. 86%,培养基的 pH 6. 0-7. 2 ；3)发酵将二级种子接种于酪酸菌发酵培养基中，接种量为酪酸菌发酵培养基体积的3 9% ；以氮气控制罐压0. 02MPa -0. 04MPa,在;M_46°C厌氧培养32_38h ；所用培养基的原料及用量为葡萄糖3. 0%-5. 0%、酵母粉1. 0% -2. 5%、黄豆粉2. 0% -3. 5%、磷酸氢二钾 0. 05% -0. 1%、硫酸镁 0. 05%-0. 1%、碳酸钙 0. 3%-0. 6%、硫酸猛 0. 002%、水 88. 2%-93. 6%, 培养基的PH 5. 8-7. 5 ；当发酵至12-14 h开始流加由葡萄糖10%-20%、水80%-90%配制成的碳源葡萄糖补料培养基，至发酵结束前8小时；当发酵至13-15 h开始流加由豆粉水解液5.0%-10.0%、磷酸二氢钾0. 1%、硫酸镁0. 1%、 水89. 8-94. 8%配制成的氮源豆粉水解液补料培养基，至发酵结束前10小时；当发酵至12h开始使用重量百分浓度17. 0%-24. 0%的氨水流加调节pH，使发酵液控制 PH6. 4-6. 8 ；发酵过程中采用间歇式搅拌，保持培养基浓度均衡；发酵过程中碳源葡萄糖补料培养基与氮源豆粉水解液补料培养基的加入体积比为1 1，但总补料量控制在初始发酵培养基体积的20-4096，最终发酵液装料系数为80-9 ； 发酵结束前4- 逐步将发酵温度提高至42-46 °C，直至芽抱形成率> 96%，结束发酵；④菌体收集经检验合格的发酵菌液，采用碟片式离心机收集菌体，获得湿菌泥并使用纯化水反复冲洗菌泥；D添加保护剂将所得的湿菌泥称重，按湿菌泥保护剂=1: 4-30的重量比，加入由脱脂奶粉5%-15%、海藻糖2%-5%、淀粉5%-15%、甘油2%_3%、维生素CO. 5%_1%、水61%_85.本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．采用补料分批发酵法制备高密度酪酸菌活菌制剂的方法，其特征在于包括下述步骤：一级种子培养：取酪酸菌种子冻干管菌种，接种于酪酸菌三角瓶一级种子培养基中，在３４－３８℃厌氧培养１２～１６ｈ；　　所用培养基的原料及用量为：葡萄糖０．５％－２．５　％、牛肉膏０．５％　－２．０％、酵母浸膏０．　３％　－０．５％、磷酸氢二钾０．０１％　－０．０５％、氯化钠０．１％－０．２　％、水９４．７５－９８．５９％，培养基的ｐＨ　６．　０－７．　０；二级种子培养：将一级种子接种于酪酸菌二级种子培养基中，接种量为酪酸菌二级种子培养基体积的３～９％；在３４－３８℃厌氧培养１２～１６ｈ；所用培养基的原料及用量为：葡萄糖１．５％－２．５　％、蛋白胨１．０％　－１．５％、酵母粉０．　５％　－１．５％、磷酸氢二钾０．０２％　－０．０５％、氯化钠０．１％－０．２　％、硫酸镁０．　０２％－０．１％、水９４．１５－９６．８６％，培养基的ｐＨ　６．　０－７．　２；发酵：将二级种子接种于酪酸菌发酵培养基中，接种量为酪酸菌发酵培养基体积的３～９％；以氮气控制罐压０．　０２ＭＰａ　－０．　０４ＭＰａ，在３４－４６℃厌氧培养３２－３８ｈ；所用培养基的原料及用量为：葡萄糖３．０％－５．０％、酵母粉１．０％　－２．５％、黄豆粉２．０％　－３．５％、磷酸氢二钾０．０５％　－０．１％、硫酸镁０．　０５％－０．１％、碳酸钙０．　３％－０．６％、硫酸锰０．００２％、水８８．　２％－９３．６％，培养基的ｐＨ　５．　８－７．　５　；当发酵至１２－１４　ｈ开始流加由葡萄糖１０％－２０％、水８０％－９０％配制成的碳源葡萄糖补料培养基，至发酵结束前８小时；当发酵至１３－１５　ｈ开始流加由豆粉水解液５．０％－１０．０％、磷酸二氢钾０．１％、硫酸镁０．１％、水８９．８－９４．８％配制成的氮源豆粉水解液补料培养基，至发酵结束前１０小时；当发酵至１２ｈ开始使用重量百分浓度１７．０％－２４．０％的氨水流加调节ｐＨ，使发酵液控制ｐＨ６．４－６．８；发酵过程中采用间歇式搅拌，保持培养基浓度均衡；发酵过程中碳源葡萄糖补料培养基与氮源豆粉水解液补料培养基的加入体积比为１：１，但总补料量控制在初始发酵培养基体积的２０－４０％，最终发酵液装料系数为８０－９２％；发酵结束前４－６ｈ逐步将发酵温度提高至４２－４６℃，直至芽抱形成率≥９６％，结束发酵；菌体收集：经检验合格的发酵菌液，采用碟片式离心机收集菌体，获得湿菌泥并使用纯化水反复冲洗菌泥；添加保护剂：将所得的湿菌泥称重，按湿菌泥：保护剂＝１：　４－３０的重量比，加入由脱脂奶粉５％－１５％、海藻糖２％－５％、淀粉５％－１５％、甘油２％－３％、维生素Ｃ０．５％－１％、水６１％－８５．５％　配制的保护剂，混合均匀；喷雾干燥制粉：将混合好的配有保护剂的菌泥，喷雾干燥，即得酪酸菌干燥菌粉活菌制剂；其中进风温度控制在８５－１２０℃；菌粉检验：每克菌粉含酪酸菌活菌数不少于１．０×１０１０个；上述各级种子培养基、发酵培养基、补料培养基、保护剂均需要经过１１０－１２３℃，１５－３０分钟的蒸汽湿热实罐灭菌，灭菌后，培养基要迅速降至３６－３７℃；上述各级种子培养基、发酵培养基、补料培养基中的原料用量均为重量百分比；配制时保证所用原料的重量百分比之和为１００％。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡军，蔡翔，丁立，陈从富，
申请(专利权)人：湖北绿雪生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：42