猪细小病毒VP2亲和肽及其编码核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及一种猪细小病毒VP2亲和肽A和B及其编码核苷酸，猪细小病毒VP2亲和肽A，氨基酸序列如序列表SEQ?ID?No.1所示，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.2所示。猪细小病毒VP2亲和肽B，氨基酸序列如序列表SEQ?ID?No.3所示，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.4所示。还涉及到一对引物VP2-3和VP2-4的核苷酸序列。本发明专利技术的多肽由于分子量较小，易穿透进入组织，比大蛋白渗透能力更强；半衰期短，在组织中蓄积很少；结构稳定且生产成本较低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种猪细小病毒VP2亲和肽及其编码核苷酸，属于生物

技术介绍
卩遼菌体表面展不技术(phagedisplay random peptide library)是20世纪80年代发展起来的利用噬菌体表达外源基因的一项分子生物学新技术。噬菌体展示技术所选用的噬菌体载体是丝状噬菌体，包括Π，fd和M13噬菌体，其中M13噬菌体最为常用。这类单链环状DNA病毒颗粒的噬菌体，编码11种蛋白质，pII1、pV1、pVI1、pVII1、pIX为其衣壳结构蛋白，其中PVIII蛋白为主要衣壳蛋白，构成噬菌体的管状结构，呈螺旋对称排列，pill和PVII蛋白位于噬菌体外壳的尾端，是噬菌体吸附宿主菌的结构。目前大多数基于VP2的研究主要集中在PPV诊断和免疫方面；关于VP2在PPV感染过程中的作用机理研究方面的资料较少。目前猪细小病毒病在我国感染十分严重，阳性率可达90%以上，给养猪业造成了巨大的经济损失。PPV VP2是构成衣壳蛋白的主要成分，其编码的多肽能自我装配成类病毒粒子，具有很强的免疫原性，是防治细小病毒病的主要蛋白。基于传统疫苗的一些弊端，人工设计合成多肽疫苗将成为可能。噬菌体展示技术在新型疫苗研制上具有独特的优势，一是:噬菌体所展示的抗原表位能保持一定的空间构象，能有效刺激几天产生免疫应答；二是:噬菌体本身既可以做为载体，又可作为良好的免疫佐剂，能增强免疫效果。同时，噬菌体展示肽库技术对淘选PPV的抗原表位，研究猪细小病毒表面分子及其结合的受体，以及病毒侵入宿主细胞的分子机制，研制更有效的抗细小病毒的药物具有重要意义。1985年，Smith第一次证实丝状噬菌体fd基因组可以通过基因工程手段，将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面。其基本原理为:选择合适的噬菌体为载体，利用基因工程技术将 外源基因克隆到其载体上，同时将外源基因编码的融合蛋白在噬菌体颗粒表面展示出来，被展示的多肽保持相对独立的空间结构和生物活性，有利于受体的识别和结合，从而组成含有多种短肽的库。外源蛋白或多肽的基因型和表现型的对应关系。噬菌体展示技术将基因表达与亲和选择相结合，其过程是将目的蛋白吸附于固相载体上，如酶标板或颗粒物质。原始肽库噬菌体与靶分子短时间孵育，洗去未结合的噬菌体，然后用特定的洗脱液将与靶蛋白特异性结合的噬菌体洗脱下来。扩增洗脱后的噬菌体，然后进行下一轮淘选，经过3 4循环的“吸附-洗脱-扩增”后，最终得到高度富集与靶蛋白结合的序列，然后通过酶联免疫吸附试验进一步鉴定筛选，获取真正的目的克隆，通过测定DNA序列，推导其氨基酸序列。最后合成多肽进一步研究其生物活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过噬菌体展示肽库技术淘选PPV的抗原表位，提供一种猪细小病毒VP2亲和肽A和B及其编码核苷酸。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:1、一种猪细小病毒VP2亲和肽A，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。2、如上所述的一种猪细小病毒VP2亲和肽A的核苷酸，核苷酸序列如序列表SEQID N0.2 所示。3、另外一种猪细小病毒VP2亲和肽B，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。4、如上所述的一种猪细小病毒VP2亲和肽B的核苷酸，核苷酸序列如序列表SEQID N0.4 所示。5、一种VP2序列的的扩增引物VP2-3和VP2-4，核苷酸序列为:VP2-3:5’ -GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3’ ；VP2-4: 5，-CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3，。本研究相对于现有技术，有如下有点及有益效果:利用噬菌体随机十二肽库技术淘选出了与VP2蛋白特异性结合的多肽。人工合成此短肽，对防治猪细小病毒病提供了一定的理论基础和试验依据。在此基础上我们拟利用病毒学实验技术分析并特性鉴定的多肽在细小病毒感染周期中的作用，为PPV感染和致病机理的研究提供重要理论依据，也为寻找PPV VP2抗原表位及病毒侵入细胞机制提供了重要的理论依据。本专利技术的多肽由于分子量较小，易穿透进入组织，比大蛋白渗透能力更强；半衰期短，在组织中蓄积很少(减少其代谢物引起并发症的风险)；结构稳定且生产成本较低。附图说明图1是VP2基因的PCR扩增结果；其中M是Marker，I是VP2 基因的扩增片段，2是阴性对照；图2是pET32a_VP2重组表达载体的PCR鉴定结果，I是VP2基因的扩增片段；图3是pET32a_VP2重组表达载体的双酶切鉴定结果，I是BamH I和Sal I双酶切结果;图4是VP2融合蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中M:低蛋白质标准分子量；1:空载体菌液；2:未诱导菌液；3 1:诱导I 5h的重组菌；8:超声破碎后菌体沉淀；9:菌体上清；图5是噬菌体结合克隆模板DNA的纯化结果；其中M:DL8000DNA Marker ; I 10:分别对应I 10噬菌体结合克隆模板DNA的纯化；图6是噬菌体PCR纯化产物图；其中M:DL8000DNA Marker ;1 10:分别对应I 10噬菌体PCR扩增产物；图7是噬菌体结合克隆的ELISA检测结果(0D490)；图8是MTT法体外检测多肽抑制效果，A为多肽对PPV抑制的MTT结果，B为多肽对PPV感染细胞的抑制率；图9是间接免疫荧光体外检测多肽抑制效果，ST细胞对照(A)，100TCID50PPV对照(B)，I 号肽 +PPV (C)，2 号肽 +PPV (D)，1+2 号肽 +PPV (E、F)；具体实施例方式本专利技术设计一对引物，扩增得到PPV VP2基因片段，构建重组质粒VP2_pET32a经IPTG诱导，在E.coli Rosetta中进行高效表达。以VP2蛋白为靶分子，利用噬菌体随即十二肽库，对VP2重组蛋白进行了五轮生物淘选，最终筛选出6种亲和力的十二肽。将亲和力最高和重复性最好的2个序列合成十二肽，通过MTT法和免疫荧光试验检测合成肽体外抗病毒活性良好。本研究结果为寻找PPV受体奠定了基础，为今后对PPV的防治及多肽疫苗的研制开发提供了一定的理论基础和试验依据。 实施例一 重组表达质粒pET32a_VP2的构建 (I) VP2序列的扩增(a)根据细菌偏爱的密码子，设计引物VP2-3和VP2-4VP2-3:5’ -GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3，(划横线处表示引入的酶切位点为BamHI)VP2-4:5’ -CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3’ (划横线处表示引入的酶切位点为 Sail)(b)进行常规链式聚合酶反应扩增VP2基因以VP2-3和VP2-4为引物，以VP2-T-6为模板，以ExTaq聚合酶进行PCR，VP2的PCR反应条件:50iil体系中含有所述PCR反应体系为50 ii L，包括5 ii LlOXEasyTaq Buffer、4u L dNTP、I u L VP2-3、I u L VP2_4、0.5u L VP2-T_6、0.5u L ExTaq聚合酶，加无菌水补至50 u L0将混合液在所述的PCR检测的反应程序为:95°C预变性5min ;94°C变性Imin ；56°C退火Imin ;72°C延伸2min ;反应进行30个循环；最后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪细小病毒VP2亲和肽A，其特征在于，氨基酸序列如序列表SEQ?ID?No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种猪细小病毒VP2亲和肽A，其特征在于，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。2.一种编码如权利要求1所述的一种猪细小病毒VP2亲和肽A的核苷酸，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。3.一种猪细小病毒VP2亲和肽B，其特征在于:氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.3所/Jn o4.一种编码如权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：任晓峰，朱卫娟，斯琴高娃，任玉东，李广兴，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：