一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用。双抗体夹心ELISA试剂盒包括：包被有鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4的酶标板、HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白另一单克隆抗体6G6，还包括封闭液、稀释液、洗涤液、显色液及终止液。该试剂盒最低病毒的检出量为10

【技术实现步骤摘要】
一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]鸡减蛋综合征病毒(egg drop syndrome virus,EDSV)能够使蛋鸡产软壳、薄壳、无壳蛋，产蛋率严重下降，从而给养鸡业带来巨大的经济损失。该病毒自1976年由荷兰科学家Van Eck首次发现并报道。EDSV现已成为世界范围内影响鸡产蛋的主要病因之一。尽管EDSV在鸭中通常看起来无害，但在先前的研究中表明，有一些EDSV菌株对鸭是具有潜在的致病性。
[0003]减蛋综合征病毒(egg drop syndrome virus,EDSV)是Ⅲ群禽腺病毒的唯一成员，同时又因该病毒基因组富含AT碱基而将其归到腺胸腺病毒属，鸭是其主要的自然宿主，所以EDSV又名鸭腺病毒1型(duck adenovirus 1)，简称Dad V
‑
1。EDSV具有典型的腺病毒形态，五邻体、六邻体和纤维蛋白(fiber)是腺病毒的三个主要结构蛋白。240个六邻体构成了腺病毒的20个面，六邻体蛋白以三聚体的形式存在，三个六邻体形成一个六边形结构。二十面体的12个顶点由五邻体蛋白和纤维蛋白以非共价键连接形成的复合物构成，五邻体蛋白以五聚体的形式形成五邻体基体，纤维蛋白则以三聚体的形式存在，并向外伸展，形成纤突。纤维蛋白由一个N端尾区、多个三连β螺旋重复片段构成的柄区以及一个C端的球状头区组成。研究表明Fiber蛋白与EDSV入侵宿主细胞有关，此外，Fiber能够最高效地诱导机体产生病毒中和抗体，是最有效的保护性抗原以及血清学检测中的理想靶标。
[0004]目前，国内外针对EDSV的诊断检测技术主要通过血凝或血凝抑制以及核酸诊断技术，而酶联免疫吸附试验(ELISA)因具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优点，已经广泛应用于人畜疾病的检测。因此，有必要研发一种检测鸡减蛋综合征病毒的ELISA试剂盒。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于：提供一种以鸡减蛋综合征病毒Fiber蛋白的两种单克隆抗体5G4和6G6为基础制备的双抗体夹心ELISA试剂盒；
[0006]还提供了一种鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒的检测方法。
[0007]本专利技术的技术方案:
[0008]一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒,包括封闭液、稀释液、洗涤液、显色液及终止液，酶标板上包被有鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4、HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体6G6，
[0009]所述包被单克隆抗体5G4或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.2所示；
[0010]所述单克隆抗体6G6或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.3所示，
轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.4所示。
[0011]所述单克隆抗体5G4由保藏编号为CCTCC NO:C2023213的杂交瘤细胞株5G4分泌。
[0012]所述单克隆抗体6G6由保藏编号为CCTCC NO:C2023214的杂交瘤细胞株6G6分泌。
[0013]其中封闭液为5％脱脂乳，稀释液和洗涤液为PBST缓冲液；显色液为TMB，终止液为2M H2SO4。
[0014]其中鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体的制备方法为：通过PCR扩增获得EDSV Fiber基因，将其与原核表达载体pET28a连接，构建重组质粒pET28a
‑
Fiber，转化大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导表达获得Fiber蛋白，然后通过镍柱纯化获得纯化的Fiber蛋白，以此作为免疫原免疫小鼠，制备多株鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体。
[0015]进一步的，将纯化后的Fiber蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞，将细胞上清进行间接ELISA和间接免疫荧光验证，筛选得到阳性克隆细胞株，经过三次亚克隆后，将杂交瘤细胞株注射小鼠进行腹水的制备，最后将得到的腹水进行纯化，得到鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4、6G6。
[0016]一种鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
[0017](1)包被：纯化后的鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4稀释后包被酶标板，4℃过夜，捕获抗体5G4的包被浓度为219ng/孔；
[0018](2)封闭：采用5％脱脂乳做封闭液，37℃封闭酶标板2h；
[0019](3)加样：加入待检样品，37℃孵育1h进行反应；
[0020](4)加酶标二抗：加入稀释后的HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白检测抗体即HRP
‑
6G6，37℃作用1h；检测抗体HRP
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6G6的稀释倍数为1:6400；
[0021](5)显色：加入TMB底物避光显色，显色时间为15min；
[0022](6)终止：加入2M H2SO4终止液，终止反应；
[0023](7)读值：酶标仪测定OD
450
。
[0024]本专利技术的单克隆抗体5G4、6G6在检测鸡减蛋综合征病毒试剂中的应用。
[0025]本专利技术的单克隆抗体5G4、6G6在检测鸡减蛋综合征病毒的试剂盒中的应用。
[0026]本专利技术的双抗体夹心ELISA法的基本原理，将定量的捕获抗体以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待检标本，通过加入检测抗体(即酶标记第二抗体)后，用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。因本专利技术的双抗夹心ELISA法使用两个特异性抗体与靶标结合，该方法具有高度的特异性和灵敏度，并且适用于复杂的样品基质的检测。
[0027]本专利技术的有益效果：
[0028]1.本专利技术选择鸡减蛋综合征病毒(EDSV)高度保守的Fiber蛋白作为靶抗原，以鸡减蛋综合征病毒Fiber蛋白的两种单克隆抗体5G4和6G6为基础制备双抗体夹心ELISA试剂盒。
[0029]本专利技术的ELISA试剂盒使用纯化后的鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4作为捕获抗体，HRP标记的另一抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体6G6作为检测抗体，并通过一系列反应条件和试剂优化，建立了双抗体夹心ELISA试剂盒。
[0030]2.本专利技术的双抗体夹心ELISA试剂盒病毒的最低检出量为10
2.9
TCID
50
/mL，灵敏度高，并且不与NDV、IBDV、IBV和FAdV
‑
4反生反应，批内和批间重复变异系数小于10％，表明建
立的双抗体夹心ELISA试剂盒具有良好的重复性。
[0031]3.与RT
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，包括封闭液、稀释液、洗涤液、显色液及终止液，酶标板上包被有鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体5G4、HRP标记的鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体6G6，所述包被单克隆抗体5G4或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.1所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.2所示；所述单克隆抗体6G6或抗体片段的重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.3所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体5G4由保藏编号为CCTCC NO:C2023213的杂交瘤细胞株5G4分泌。3.根据权利要求1所述的一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体6G6由保藏编号为CCTCC NO:C2023214的杂交瘤细胞株6G6分泌。4.根据权利要求1所述的一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，其中封闭液为5％脱脂乳，稀释液和洗涤液为PBST缓冲液；显色液为TMB，终止液为2M H2SO4。5.根据权利要求1所述的一种检测鸡减蛋综合征病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于，鼠抗EDSV Fiber蛋白单克隆抗体的制备方法为：通过PCR扩增获得EDSV Fiber基因，将其与原核表达载体pET28a连接，构建重组质粒pET28a
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Fiber，转化大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导表达获得Fiber蛋白，然后通过镍柱纯化获得纯化的...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏蔷，张改平，刘运超，宋亚鹏，柴书军，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：