【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，属于作物抗病性鉴定。
技术介绍
1、花生(arachis hypogaea l.)作为重要的油料和经济作物，保证其产量和品质的稳定对花生实际生产实践至关重要。花生生长发育过程常受到多种病虫害侵扰，花生网斑病是由真菌引起的一种叶部病害，在病害常发产区往往造成减产10％-20％，严重时会减产30％以上。因此，鉴定和创制花生抗网斑病遗传种质资源有重要意义。
2、花生网斑病抗性鉴定方法主要分为三类：其一为根据田间自然发病鉴定，发病情况受自然环境影响较大；其二为田间人工接种诱发病害发生进行鉴定，但受季节影响且周期较长；第三类是在室内进行人工接种鉴定，该方法周期短、效率较高，且环境条件容易控制，鉴定结果重复性好。利用自然发病和田间人工接种，研究者在不同区域内筛选出了一些高抗或抗病种质，如p12、群育101、鲁花11号、花育36、郑8903等。在对野生种及其种间杂交后代研究过程中，申请人发现花生野生种a.duranensis抗网斑病，并通过种间杂交获得了一系列四粒红与a.duranensis的异染色体系，由于特殊的染色体组成，部分杂种后代育性偏低，早代材料数量稀缺。而目前常用的花生网斑病鉴定方法，通常都以整株作为鉴定和接种对象，对鉴定材料消耗较大，严重影响了珍稀花生种质尤其是种间杂种后代的网斑病抗性鉴定效率，从而影响了野生种质中网斑病优异基因的利用。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供一种基于生根离体叶
2、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、一种基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，包括以下步骤：
4、(1)花生离体叶片培养与生根诱导：从生长良好的花生植株上剪取健康且无损伤的顶端倒数第三片展开叶片，置于生根溶液中浸泡6h，将浸泡过的叶片插入装满蛭石的营养钵中，浇灌营养液后用塑料薄膜覆盖，保湿培养出根；
5、(2)花生种间杂交后代材料的细胞学鉴定：剪取新鲜根尖用于染色体制片，然后以染色体特异的寡核苷酸库为探针对种间杂种或附加系材料进行荧光原位杂交鉴定；
6、(3)孢子悬浊液的接种：接种前向网斑病病原菌的分生孢子悬浊液中加入吐温20，使吐温20的终浓度为1％(v/v)，然后将分生孢子液均匀地喷洒到叶片上，在25℃-28℃条件下薄膜覆盖保湿培养20天，分生孢子液悬浊液的接种浓度为2×106～2.5×106个/ml；
7、(4)花生离体叶片的网斑病抗性鉴定。
8、所述步骤(1)中剪取的叶片为包含4片小叶的整片花生羽状复叶，剪取花生叶片时的切口位置为叶柄基部，且剪切时采用斜切。
9、其中，所述步骤(1)中生根的培养条件为：25℃-28℃条件下恒温培养15-20天；生根溶液为0.01mg/ml的α-萘乙酸；蛭石经灭菌及复水处理过；营养液为不含蔗糖和琼脂的1/2ms营养液。
10、进一步，所述步骤(3)中的分生孢子液喷洒的叶片为生根的健康叶片。
11、进一步，所述步骤(4)网斑病抗性鉴定中采用的分级标准为：
12、花生离体叶片的网斑病抗性鉴定按照病斑与叶片面积比计算病情级数，病情分级标准为：0级：未检测到病斑；1级：0<病斑面积<1％；2级：1％≤病斑面积<3％；3级：3％≤病斑面积<5％；4级：5％≤病斑面积<7％；5级：7％≤病斑面积<10％；6级：10％≤病斑面积<15％；7级：15％≤病斑面积<18％；8级：18％≤病斑面积<20％；9级：病斑面积≥20％，根据病情级数进一步确定抗病指数。
13、进一步，所述抗病指数的抗性评价标准为：
14、根据病情级数计算每种材料的病情指数di，病情指数＝{[σ(各级病株/叶数×病级)]/(调查总株/叶数×9)}×100，根据病情指数进一步计算相对抗病指数rdi，相对抗病指数＝1-某品种病情指数/最感品种病情指数，根据相对抗病指数对材料进行抗病性评价，将抗病性划分为6级：rdi：1.0为无病斑反应i；rdi：0.80～0.99为高抗hr；rdi：0.60～0.79为抗r；rdi：0.40～0.59为中抗mr；rdi：0.20～0.39为感s；rdi<0.20为高感hs。
15、本专利技术的有益效果：
16、本专利技术基于离体叶片生根可以在不影响植株正常生长发育过程的条件下实现在室内环境控制条件下对稀缺材料的网斑病接种及抗性鉴定，提高了优异种质网斑病抗性的鉴定效率。而且叶片生根后，一方面可以利用根尖分析材料的染色体组成，鉴定材料身份；另一方面的叶片具备了生命功能，提高了抗性鉴定的准确性。
17、本专利技术方法操作简单高效，能对单个或少数珍稀花生材料进行网斑病抗性评价，有效缩短了抗病育种周期。
18、本专利技术方法对花生网斑病及其它叶部病害的抗性育种具有重要的潜在应用价值。
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1.一种基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)中剪取的叶片为包含4片小叶的整片花生羽状复叶，剪取花生叶片时的切口位置为叶柄基部，且剪切时采用斜切。
3.根据权利要求1所述的基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)中生根的培养条件为：25℃-28℃条件下恒温培养15-20天。
4.根据权利要求1所述的基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)中的生根溶液为0.01mg/mL的α-萘乙酸。
5.根据权利要求1所述的基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)中的蛭石经灭菌及复水处理过。
6.根据权利要求1所述的基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)中的营养液为不含蔗糖和琼脂的1/2MS营养液。
7.根据权利要求1所述的基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法
8.根据权利要求1所述的基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，其特征在于，所述步骤(4)网斑病抗性鉴定中采用的分级标准为：
9.根据权利要求8所述的基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，其特征在于，所述抗病指数的抗性评价标准为：
...【技术特征摘要】
1.一种基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)中剪取的叶片为包含4片小叶的整片花生羽状复叶，剪取花生叶片时的切口位置为叶柄基部，且剪切时采用斜切。
3.根据权利要求1所述的基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)中生根的培养条件为：25℃-28℃条件下恒温培养15-20天。
4.根据权利要求1所述的基于生根离体叶片的花生网斑病室内接种鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)中的生根溶液为0.01mg/ml的α-萘乙酸。
5.根据权利要求1所述的基于生根离体...
【专利技术属性】
技术研发人员：张新友，杜培，李晨玉，陈国权，孙子淇，吴晓慧，刘华，董文召，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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