一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法及试剂盒技术

一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法及试剂盒，对猪圆环病毒2型即PCV2的ORF2基因设计了相应的特异性引物和探针，与PCV1、CSFV、PRRSV、PRV不发生交叉反应，检测极限和定量极限分别为10和100拷贝数。本发明专利技术的试剂盒灵敏度高，特异性强，稳定性好，循环阈值(Ct)与标准DNA模板在102～106拷贝/μL浓度范围内具有极好的线性关系，相关系数为1；重复性好，批内实验中Ct值的变异系数在0.59％到1.05％之间，批间实验的Ct值变异系数为1.9％到4.2％，为猪圆环病毒Ⅱ型的检测和流行病学的调查提供了一种简便快速的诊断方法。供了一种简便快速的诊断方法。供了一种简便快速的诊断方法。

【技术实现步骤摘要】
一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于猪圆环病毒的检测
，具体涉及一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒(Porcine Circovirus Type，PCV)为圆环病毒科(Circoviridae)、圆环病毒属(Circovirus genus)的成员，具有两个血清型，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。通常认为，PCV1不具致病性，PCV2具有致病性，PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。
[0003]PCV2主要破坏猪的免疫系统，造成机体免疫抑制，抵抗力降低，导致被感染的猪产生其他病原微生物的继发感染。PCV2与猪的其他多种临床疾病也密切相关。自1997年在加拿大首次报道PMWS以来，PCV2在全世界养猪国家和地区迅速传播，并且流行范围不断扩大，给养猪业造成了巨大的经济损失，引起了各国养猪业的高度重视。对PCV2感染猪的初期诊断与病猪的淘汰是PMWS防治的关键，有必要开发出一种PCV2的定性、定量快速检测方法用于PMWS的防控。
[0004]目前，对PCV2的检测技术主要有免疫学检测方法和分子生物学检测方法。免疫学检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)、单层过氧化物酶试验(IPMA)等。其中，ELISA、IFA和IPMA主要用于PCV2血清的检测。
[0005]PCV2的分子生物学检测技术中最常见的是PCR技术，但常规PCR一般只能定性，不能定量。基因芯片通过荧光染料信号强度来推算每个探针对应的样品量，基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，局限性是嵌合体或部分特殊变异检出率低。
[0006]实时荧光定量PCR技术是以定性PCR技术为基础发展起来的，由美国Applied Biosystems公司于1996年推出的一种新定量实验技术是在定性PCR技术基础上发展起来的，是到目前为止敏感性最高的核酸检测和定量技术。
[0007]实时荧光定量PCR(Real
‑
time fluorescence Quantitative PCR，FQ
‑
PCR/qPCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。实时荧光定量常用的荧光化学分类有SYBR Green I法和特异性TaqMan探针法。特异性TaqMan荧光定量法的发光机理是以TaqMan荧光探针为基础，TaqMan荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。
[0008]常用的荧光基团有FAM、VIC、TAMRA、HEX、ROX、JOE和TET等。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5
’→3’
外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步，从而
实现定量。qPCR技术是以荧光共振能量转移原理为基础，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值(Cycle threshold，循环阈值)和标准曲线对未知模板的起始浓度进行定量的技术。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法及试剂盒，灵敏度高，特异性强，稳定性好，既能定性、又能定量的实现检测PCV2的存在，建立的标准曲线在102－106拷贝/μL的浓度范围内呈极好的线性关系，回归系数可达1；重复性好，批内实验中Ct值的变异系数在0.59％到1.05％之间，批间实验的Ct值变异系数为1.9％到4.2％。
[0010]为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0011]一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
[0012]1)设计引物
[0013]对PCV2的ORF2基因，GenBank登录号为EU921257.1，设计相应的特异性引物P1、P2和探针probe，具体序列如下：
[0014]PCV2
‑
P1:5
’‑
CGGATATTGTATTCCTGGTCGTA
‑3’
；
[0015]PCV2
‑
P2:5
’‑
CCTGTCCTAGATTCCACTATTGATT
‑3’
；
[0016]PCV2
‑
Probe:FAM
‑5’‑
CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC
‑3’‑
TAMR A；
[0017]2)配制PCR反应体系
[0018]在无PCV2阳性模板或PCR反应产物的独立空间内进行荧光定量PCR总体系的配置：向离心管中加入预混物，包含10
×
Buffer、dNTPs、Mg
2+
、Taq酶、UDG酶、Rox矫正染料；加入引物P1、P2和探针Probe，余量为灭菌双蒸水；
[0019]涡旋混匀、瞬离，然后将配置好的总体系进行分装，空白对照加入双蒸水，所有的荧光定量PCR反应均做3次平行重复；
[0020]3)加入模板
[0021]在独立空间内将配好的PCR体系加入阳性质粒或待检样品模板DNA，得到PCR反应液，加好立即盖严管盖，瞬离，避免产生气泡；模板要按照拷贝数从低到高的顺序依次加入，且此空间内不能放置用于PCR体系配制的原料；
[0022]4)荧光定量PCR扩增
[0023]将配好的PCR反应液进行荧光定量PCR扩增，延伸阶段收集荧光信号，反应结束后进行荧光定量PCR扩增结果分析，以浓度梯度为2
×
102‑2×
106拷贝/μL的10倍梯度稀释的PCV2阳性质粒为模板的扩增结果制作标准曲线，线性系数R2为1；以待测样品模板的扩增结果带入标准曲线，获得定量结果。
[0024]优选地，所述PCR反应体系中，各成分的终浓度：引物P1和P20.24
‑
0.4μM、探针probe 0.16
‑
0.24μM，10
×
buffer、dNTP 0.25mM、Mg
2+
0.3
‑
0.6mM、Taq DNA聚合酶0.2
‑
0.3μL、UDG酶0.1
‑
0.2μL、ROX 0.2
‑
0.5μL。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：1)设计引物对PCV2的ORF2基因，GenBank登录号为EU921257.1，设计相应的特异性引物P1、P2和探针probe，具体序列如下：PCV2
‑
P1:5
’‑
CGGATATTGTATTCCTGGTCGTA
‑3’
；PCV2
‑
P2:5
’‑
CCTGTCCTAGATTCCACTATTGATT
‑3’
；PCV2
‑
Probe:FAM
‑5’‑
CTAGGCCTACGTGGTCTACATTTC
‑3’‑
TAMRA；2)配制PCR反应体系在无PCV2阳性模板或PCR反应产物的独立空间内进行荧光定量PCR总体系的配置：向离心管中加入预混物，包含10
×
Buffer、dNTPs、Mg
2+
、Taq酶、UDG酶、Rox矫正染料；加入引物P1、P2和探针Probe，余量为灭菌双蒸水；涡旋混匀、瞬离，然后将配置好的总体系进行分装，空白对照加入双蒸水，所有的荧光定量PCR反应均做3次平行重复；3)加入模板在独立空间内将配好的PCR体系加入阳性质粒或待检样品模板DNA，得到PCR反应液，加好立即盖严管盖，瞬离，避免产生气泡；模板要按照拷贝数从低到高的顺序依次加入，且此空间内不能放置用于PCR体系配制的原料；4)荧光定量PCR扩增将配好的PCR反应液进行荧光定量PCR扩增，延伸阶段收集荧光信号，反应结束后进行荧光定量PCR扩增结果分析，以浓度梯度为2
×
102‑2×
106拷贝/μL的10倍梯度稀释的PCV2阳性质粒为模板的扩增结果制作标准曲线，线性系数R2为1；以待测样品模板的扩增结果带入标准曲线，获得定量结果。2.根据权利要求1所述猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系中，各成分的终浓度：引物P1 0.24
‑
0.4μM、引物P2 0.24
‑
0.4μM、探针probe 0.16
‑
0.24μM，10
×
buffer、dNTP 0.25mM、Mg
2+
0.3
‑
0.6mM、Taq DNA聚合酶0.2
‑
0.3μL、UDG酶0.1
‑
0.2μL、ROX 0.2
‑
0.5μL。3.根据权利要求1所述猪圆环病毒2型的荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵凯，杨丹，张晓霞，张琪，张皖静，浦心袆，赵斌安，赵悦琪，钱忠辉，张俊平，丁卫星，张春玲，赵本进，王瑞阳，张华弟，
申请(专利权)人：上海佳牧生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：