一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于猪瘟病毒荧光定量RT

【技术实现步骤摘要】
一种用于猪瘟病毒荧光定量RT
‑
PCR检测的引物及试剂盒


[0001]本专利技术涉及猪瘟病毒检测
，尤其是涉及一种用于猪瘟病毒荧光定量RT
‑
PCR检测的引物及试剂盒。

技术介绍

[0002]猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）俗称“猪霍乱”、“烂肠瘟”，是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起一种的高度接触性致死性传染病，主要表现为发烧、厌食、腹泻、死亡，母猪流产等。对养猪业危害极大，被世界动物卫生组织（OIE）列入OIE疾病名录（OIE Listed diseases）。近几年猪瘟发病特点上多呈现非典型性，临床症状不明显，温和性及隐性感染的现象，免疫失败现象普遍存在。
[0003]在19世纪50年代我国研制出猪瘟兔化弱毒疫苗，应用到猪瘟防控后，CSFV感染得到了有效的控制。但在疫苗接种不完善的地方性受感染的国家中，毒性较低猪瘟病毒株的流行往往被管理和生物安全性问题所掩盖，如饲料喂养、公共设施使用等问题，该病毒可在家养猪中长期保持活性。因此，建立一种快速灵敏、特异性强、操作简单、经济实用的诊断方法势在必行。
[0004]CSFV只有一个血清型，但根据病毒核苷酸序列的差异，该病毒可分为三个基因型，即基因1型、基因2型和基因3型，每个基因型又含有3至4个基因亚型。CSFV基因组大小约12.3Kb，由5
’
端非编码区(5
’‑
UTR)、3
’
端非编码区（3
’‑
TUR）和一大的开放阅读框架（ORF）三部分构成，该开放读码框（ORF）编码约3898个氨基酸的多聚蛋白，在病毒和宿主细胞蛋白酶作用下，多聚蛋白在翻译的同时被加工成12种成熟的病毒蛋白，各蛋白的基因排列顺序从N端到C端依次为：Npro、C、E0（Erns）、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。CSFV基因组编码的12种病毒蛋白中，C、E0、E1、E2为结构蛋白，其它为非结构蛋白。CSFV5'
‑
UTR由360
‑
373个核苷酸组成，随毒株序列不同而有差异。5
’
端缺乏甲基化“帽子”结构，序列保守性很高，可形成稳定的二级结构，在基因表达和复制中起重要调控作用。在5
’‑
UTR上含有多个AUG密码子和一个高度结构化的核糖体进入位点（IRES）。IRES5
’
边界位于核苷酸28～66之间，这些核苷酸形成一个茎环结构（发卡B），该结构可能对于IRES的活性十分重要。CSFV的3
’‑
UTR由226
‑
243个核苷酸组成，也随毒株不同而有差异，3
’
端缺乏Poly（A）尾结构，在属内保守性很高，可能在病毒复制中起一定作用。
[0005]建立特异、灵敏、快速的检测方法，对开展畜群猪瘟病毒监测工作来说是必须的，荧光定量PCR检测方法符合这一要求。目前研究表明，由于猪瘟病毒只有一种血清型，且针对于猪瘟的治疗没有特效药，在防控上主要结合综合性预防措施，以疫苗接种为主。迄今为止国内针对CSFV的常用有效疫苗为猪瘟兔化弱毒疫苗（即C株），该疫苗是在19世纪50年代由我国研制成功的，使用该疫苗预防猪瘟既可以降低成本又可以限制传播，但是近些年免疫失败现象普遍存在。日常监测是掌握畜群健康状态的重要手段，同时也可从侧面反映管理是否合理，也是适时注射疫苗的主要依据。
[0006]目前已建立的用于检测CSFV的方法主要有病毒分离、琼脂扩散、酶联免疫吸附试
验、RT
‑
PCR、LAMP等。病毒分离实验方法虽然准确，但是该方法也存在耗时长，操作繁琐，需要较高的试验条件和操作水平，容易污染等缺点，不适合基层临床诊断；酶联免疫吸附方法操作要求高，需要酶标仪测定结果，且不适合做单个样本的检测，虽然耗时比病毒分离试验要短，但仍需要2~4小时不等；LAMP检测虽然耗时较短，但是极易出现假阳性，且对于试剂、技术人员的要求较高。上述的种种不便都限制了它们在猪瘟病毒临床检测中的实际应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种用于猪瘟病毒荧光定量RT
‑
PCR检测的引物及试剂盒，操作简便、灵敏、特异、快速的猪瘟病毒定性定量检测方法，对实际生产养殖过程中的猪瘟病毒进行监测，从而限制猪瘟病毒的流行。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了一种用于猪瘟病毒荧光定量RT
‑
PCR检测的引物，所述引物为如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成的引物对。
[0009]优选的，引物具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的延长序列。
[0010]一种用于猪瘟病毒荧光定量RT
‑
PCR检测的试剂盒，包括具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的单链DNA引物对、探针、核酸提取液、2
×
Direct qRT
‑
PCR Mix、酶混合液、阴性对照、阳性对照。
[0011]优选的，阳性对照是由序列为SEQ ID NO.3所示的DNA片段与载体相连后得到的重组质粒。
[0012]优选的，探针为与如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列匹配的单链DNA。
[0013]优选的，试剂盒的样本来源于猪源样本和非猪源样本，猪源样本来源于猪血液、扁桃体、淋巴结或脾脏，非猪源样本来源于猪生活的饲料、环境。
[0014]优选的，试剂盒在猪瘟病毒检测中的应用。
[0015]优选的，试剂盒检测时，PCR程序为第一阶段1个循环，50℃ 15min，第二阶段1个循环95℃ 3min，第三阶段40个循环，95℃ 15s，60℃ 30s后采集荧光信号。
[0016]因此，本专利技术采用上述一种用于猪瘟病毒荧光定量RT
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PCR检测的引物及试剂盒，在尽量缩短了检测时间的同时，提高了检测的灵敏度，并不增加非特异性干扰，还可降低操作误差，提高测定的精确度。
[0017]本专利技术试剂盒的检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适用范围广、储存简单、保质期长的优点。本专利技术的试剂盒可实现猪瘟病毒现场快速检测，具有较高的实用价值和推广价值。
[0018]下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
[0019]图1是本专利技术实施例一中猪瘟病毒基因组目的片段常规RT
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PCR扩增；图2是本专利技术实施例一中引物和对应的探针对比试验图；图3是本专利技术实施例五中实时荧光定量RT
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PCR标准曲线；图4是本专利技术实施例六中实时荧光定量RT
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PCR特异性试验图；图5是本专利技术实施例七中实时荧光定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于猪瘟病毒荧光定量RT
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PCR检测的引物，所述引物为如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成的引物对。2.根据权利要求1所述的一种用于猪瘟病毒荧光定量RT
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PCR检测的引物，其特征在于：引物具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的延长序列。3.一种用于猪瘟病毒荧光定量RT
‑
PCR检测的试剂盒，其特征在于：包括具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的单链DNA引物对、探针、核酸提取液、2
×
Direct qRT
‑
PCR Mix、酶混合液、阴性对照、阳性对照。4.根据权利要求3所述的一种用于猪瘟病毒荧光定量RT
‑
PCR检测的试剂盒，其特征在于：阳性对照是由序列为SEQ ID NO.3所示的DNA片段与载体相连后得到的...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟鸣，赵荣茂，苏丁然，王学君，
申请(专利权)人：北京纳百生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：