三七中人参潜隐病毒4的实时荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种三七中人参潜隐病毒4的实时荧光定量PCR检测方法，该方法以染毒三七叶片的cDNA为模板，以PCV4

【技术实现步骤摘要】
三七中人参潜隐病毒4的实时荧光定量PCR检测方法


[0001]本专利技术涉及植物病毒分子检测领域，具体而言，涉及一种人参潜隐病毒4的实时荧光定量PCR检测方法。

技术介绍

[0002]近年来，植物病毒病在世界各国的危害日趋严重，所发现和报道的病毒种类日益增多。而植物病毒的检测与鉴定，是认识病毒病害、防治病毒病的基础工作，也是植物病毒分类学研究的一个重要环节。在上个世纪早期，植物病毒的鉴定与分类主要根据寄主范围、症状及介体传播方式等生物学性状；后来，理化特性分析及血清学技术广泛应用于植物病毒的鉴定与分类研究。随着分子生物学的迅速发展，许多分子生物学技术被应用于植物病毒的检测鉴定，给病毒分类鉴定提供了丰富可靠的技术。近年来，病毒的检测技术不断发展进步，诊断、检测植物病毒的方法越来越多，已形成一个系统的体系。
[0003]三七[Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen]是五加科人参属多年生药用草本植物，具有定痛消肿、止血散淤、抗癌、抗高血压、提高免疫力和保护心脑血管等多种功效，被广泛用作临床药物和滋补产品。三七主产于云南文山州，随着近年来三七产业的快速发展，在大规模生产中面临的一些问题也随之而来，其中三七病毒病的日益严重，对三七的产量和质量造成了严重影响。据报道，感染三七的病毒包括黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、番茄花叶病毒（Tomato masaic virus, ToMV）、番茄斑驳病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）、三七Y病毒（Panax virus Y, PnVY）、中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV）及其卫星（Tomato yellow leaf curl China betasatellite, TYLCCNB）、三七A病毒（Panax notoginseng virus A, PnVA）及烟草扭脉病毒（Tobacco vein distorting virus, TVDV）等多种病毒。此外，还有学者将三七病毒病分为皱缩型、麻点叶斑型、褪绿型、花叶型、驴耳型、丛顶型、复合型等7个类型（陈昱君, 王勇, 杨建忠, 等. 三七皱缩型病毒病与环境因子的关系研究.现代农业科技, 2014, 16: 108
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109）。病毒感染三七后，病株株高、茎粗、叶长、叶宽、单株鲜重均明显减少，个别三七园会出现整体毁园现象。而目前由于生产上使用带病种子（苗），病健植株混合采挖、运输和收储，以及现有商品化病毒病药剂数量少、防效差等因素，使得三七病毒病的危害呈蔓延之势。
[0004]陈燕芳等通过寄主范围测定、电镜观察和血清学检测等方法对三七病毒病进行鉴定（陈燕芳, 金羽, 李桂芬, 等.三七病毒病鉴定初报.植物检疫, 2004(04): 212
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213）。金羽等分别利用生物学、血清学以及分子生物学方法来鉴定三七病毒病病原（金羽. 三七病毒病病原的初步研究.东北农业大学, 2005）。此外，杨馨等利用PCR/RT
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PCR技术对疑似病毒病症状的三七叶片样品进行病毒检测鉴定（杨馨, 孟鈺, 李梅蓉, 等. 云南三七病毒病的发生及病毒种类检测. 植物病理学报, 2019, 49(04): 456
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464）。实时荧光定量PCR技术作为一种高灵敏、高特异性的核酸检测手段，相较于病毒分离培养和电镜观察等方法快捷准确，已在由真菌、细菌、病毒、线虫等引起植物病害的病原诊断和防治控制研究中得
到了广泛应用。此外，在研究植物病害的产生机理及发生规律时，还能获知复杂环境中植物病毒含量的动态变化，为预防、早期诊断和动态监测提供技术保障。
[0005]植物潜隐病毒（cryptic virus）属于分裂病毒科，通常包含2至3个单顺反子基因组dsRNA片段，这些基因组片段被单独封装，称为二分病毒和三分病毒。此外，潜隐病毒通过花粉或种子传播，主要与其他病毒混合感染真菌、植物和原生动物（Kumar S,Subbarao B L,Kumari R, et al. Molecular characterization of a novel cryptic virus infecting pigeonpea plants［J］. PLoS One, 2017, 12(8): e0181829）。其中，潜隐病毒在无症状以及有斑驳、叶斑和坏死的植物中发现较多，且大多数单一的潜隐病毒不会引起明显的症状，或者在少数情况下会引起非常轻微的症状（Vazquez I I, Adams I P, Hodgetts J, et al. High throughput sequencing and RT
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qPCR assay reveal the presence of rose cryptic virus
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1 in the United Kingdom［J］. Journal of Plant Pathology, 2019, 101: 1171
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1175）。人参潜隐病毒4（Panax cryptic virus 4, PCV4）是首尔国立大学农业与生命科学研究所在人参中发现的一种新型潜隐病毒，并获得了1609bp长的外壳蛋白全基因序列（MT159322.1），但目前未见有关于PCV4的深入研究报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种三七中人参潜隐病毒4（PCV4）的实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法可实现供试材料三七中人参潜隐病毒的定量检测，同时具有检测时间短以及灵敏度高的技术特点。
[0007]本专利技术人参潜隐病毒4实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：（1）以感染人参潜隐病毒4的三七叶片的cDNA为模板，采用引物PCV4
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cp
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F和PCV4
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cp
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R进行PCR扩增，PCR扩增产物回收纯化后，与pGEM
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T载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性克隆提取质粒，获得重组质粒标准品pGEM
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T
‑ꢀ
PCV4，其中引物PCV4
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cp
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F核苷酸序列如SEQID NO:1所示，引物PCV4
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cp
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R核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；（2）以经过梯度稀释的重组质粒标准品为模板，采用上游引物PCV4
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QF和下游引物PCV4
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QR进行实时荧光定量PCR，以重组质粒标准品的拷贝数浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线，其中上游引物PCV4
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QF核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物PCV4
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QR核苷酸序列如SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三七中人参潜隐病毒4的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）以感染人参潜隐病毒4的三七叶片的cDNA为模板，采用引物PCV4
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cp
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F和PCV4
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cp
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R进行PCR扩增，PCR扩增产物回收纯化后，与pGEM
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T载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性克隆提取质粒，获得重组质粒标准品pGEM
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T
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PCV4，其中引物PCV4
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cp
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F核苷酸序列如SEQID NO:1所示，引物PCV4
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cp
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R核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；（2）制备一系列浓度梯度的重组质粒标准品溶液，并以重组质粒标准品溶液为模板，采用上游引物PCV4
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QF和下游引物PCV4
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QR进行实时荧光定...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘迪秋，陈虹均，陈晓华，李有玉，孙皓，王瀚林，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：