一种鉴定鸡细小病毒的引物对及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴定鸡细小病毒的引物对及其应用。本发明专利技术的引物对由引物ChPV‑F和ChPV‑R组成，分别如序列表1、2所示。本发明专利技术还保护所述引物对在鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒中的应用、鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒中的应用。本发明专利技术建立的二温式PCR可用于快速检测鸡细小病毒，适于大批量检测，既可节约成本和节省时间，又能减少污染，具有很高的实用价值。

Primer pair for identifying chicken parvovirus and application thereof

The invention discloses a primer pair for identifying chicken parvovirus and its application. The invention of primers by primer ChPV and ChPV F R, 1, 2 respectively, as shown in the sequence list. The invention also protects the application of the primer pair in the identification of whether the virus to be tested is a chicken parvovirus, and the application of the sample to determine whether the test sample contains chicken parvovirus. The two temperature PCR can be used for rapid detection of chicken parvovirus and is suitable for mass detection, which can save cost, save time and reduce pollution, and has high practical value.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鉴定鸡细小病毒的引物对及其应用。
技术介绍
鸡细小病毒(Chincken parvovirus，ChPV)是引起鸡肠道疾病重要的病原体之一，可以引起以腹泻、精神抑郁、体温调节障碍、生长迟缓、增加饲料消耗等为特征的急性或慢性肠道性疾病、矮小综合症、营养不良综合症。鸡细小病毒在鸡群中普遍存在，主要侵害雏鸡，但以商品肉鸡感染率较高、蛋鸡或种鸡次之。自2010年以来，北美、波兰、匈牙利、克罗地亚、巴西、南韩等国家相继暴发了该病，给养鸡业造成较大的经济损失。因此，建立ChPV的快速检测方法，是有效防制我国ChPV的技术保障。目前，鉴定病毒的方法主要依靠传统的病毒分离、琼脂扩散试验和ELISA等，但是这些方法通常具有耗时费力且敏感性不高等弊端。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴定鸡细小病毒的引物对及其应用。本专利技术提供了一种引物对，由引物ChPV-F和引物ChPV-R组成；所述引物ChPV-F为如下(a1)或(a2)；(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物ChPV-R为如下(a3)或(a4)；(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。所述引物对的用途为如下(b1)至(b4)中的任意一种：(b1)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒；(b2)制备用于鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒的试剂盒；(b3)鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒；(b4)制备用于鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒的试剂盒。本专利技术还保护所述引物对的应用，为如下(b1)至(b4)中的任意一种：(b1)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒；(b2)制备用于鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒的试剂盒；(b3)鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒；(b4)制备用于鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒的试剂盒。本专利技术还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒；(c2)鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒。本专利技术还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。本专利技术还保护一种鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒的方法，包括如下步骤：(1)提取待测病毒的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用所述的引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物中含有297bp-307bp的DNA片段、待测病毒为或候选为鸡细小病毒，如果PCR扩增产物中不含有297bp-307bp的DNA片段、待测病毒为或候选为非鸡细小病毒。本专利技术还保护一种鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒的方法，包括如下步骤：检测待测病毒的基因组DNA中是否含有所述引物对的靶序列，如果所述基因组DNA中含有所述引物对的靶序列、待测病毒为或候选为鸡细小病毒，如果所述基因组DNA中不含有所述引物对的靶序列、待测病毒为或候选为非鸡细小病毒。本专利技术还保护一种鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒的方法，包括如下步骤：(1)提取待测样本的总DNA；(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，采用所述的引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物中含有297bp-307bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有鸡细小病毒，如果PCR扩增产物中不含有297bp-307bp的DNA片段、待测样本不含有或疑似不含有鸡细小病毒。本专利技术还保护一种鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒的方法，包括如下步骤：检测待测样本的总DNA中是否含有所述引物对的靶序列，如果所述总DNA中含有所述引物对的靶序列、待测样本含有或疑似含有鸡细小病毒，如果所述总DNA中不含有所述引物对的靶序列、待测样本不含有或疑似不含有鸡细小病毒。以上任一所述待测病毒具体可为鸡细小病毒、鸡新城疫病毒、马立克病毒、H9亚型禽流感病毒、传染性支气管炎病毒或传染性喉气管炎病毒。以上任一所述待测样本具体可为鸡病料，例如鸡喉头拭子、鸡泄殖腔拭子、生鲜鸡肉、生鲜鸡内脏、鸡肉加工品、鸡内脏加工品等。以上任一所述“引物对的靶序列”具体可为大小为297bp-307bp的DNA片段。所述DNA片段可为如下(d1)或(d2)：(d1)序列表的序列3所示的DNA分子；(d2)与序列表的序列3具有99％以上同源性的DNA分子。以上任一所述PCR扩增具体可为二温式PCR扩增。以上任一所述PCR扩增的退火温度具体为61.4℃。以上任一所述PCR扩增的反应体系中，ChPV-F和ChPV-R的浓度均为10pmol/μL。以上任一所述PCR扩增的反应体系(25μL)具体可为：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL，ChPV-F和ChPV-R各1μL，最后用ddH2O补足至25.0μL。以上任一所述PCR扩增的反应程序具体可为：95℃预变性3min；94℃变性15s，61.4℃退火30s，共进行30个循环，72℃延伸10min。PCR方法则具有操作简单快速、特异性强、敏感性高、重复性好等特点。二温式PCR是在常规三温式PCR基础上发展而成的更简便的检测技术。在二温式PCR中，退火和延伸在同一温度下进行，比常规PCR的退火温度高，因此不仅提高了该二温式PCR的特异性，而且二温式PCR节省了反复升温降温的耗时，提高了诊断效率。本专利技术建立的二温式PCR可用于快速检测ChPV的感染，适于大批量检测，既可节约成本和节省时间，又能减少污染，具有很高的实用价值。附图说明图1为实施例2中二温式PCR反应优化对应的电泳图。图2为实施例3中特异性检测对应的电泳图。图3为实施例4中敏感性检测对应的电泳图。图4为实施例5中临床样品检测对应的电泳图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。鸡细小病毒(chicken parvovirus，缩写为ChPV)：参考文献：Day J M，Zsak L. Determination and analysis of the full-length chicken parvovirus genome.[J].Virology，2010，399(1)：59-64.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。鸡新城疫病毒(NDV)：参考文献：谢芝勋，谢丽基，刘加波，等.禽流感和新城疫病毒二温式荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯，2008，19(3)：410-413.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。马立克病毒(MDV)：参考文献：邓显文，谢芝勋，谢志勤，等.鸡传染性贫血病毒病LAMP快速可视化检测方法的建立[J].家畜生态学报，2011，32(6)：57-60.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。H9亚型禽流感病毒(AIV H9)：参考文献：谢芝勋，谢丽基，刘加波，等.禽流感和新城疫病毒二温式荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯，2008，19(3)：410-413.；公众可以从广西壮族本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物对，由引物ChPV‑F和引物ChPV‑R组成；所述引物ChPV‑F为如下(a1)或(a2)；(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物ChPV‑R为如下(a3)或(a4)；(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.引物对，由引物ChPV-F和引物ChPV-R组成；所述引物ChPV-F为如下(a1)或(a2)；(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物ChPV-R为如下(a3)或(a4)；(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。2.权利要求1所述的引物对的应用，为如下(b1)至(b4)中的任意一种：(b1)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒；(b2)制备用于鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒的试剂盒；(b3)鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒；(b4)制备用于鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒的试剂盒。3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒；(c2)鉴定待测样本是否含有鸡细小病毒。4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。5.一种鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒的方法，包括如下步骤：(1)提取待测病毒的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物中含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，奉彬，邓显文，张艳芳，黄娇玲，王盛，范晴，谢志勤，黄莉，谢丽基，曾婷婷，罗思思，刘加波，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45