一种同时鉴别8种牛病原体的引物组合及GeXP检测方法技术

本发明专利技术公开了一种同时鉴别8种牛病原体的引物组合及GeXP检测方法。本发明专利技术的引物组合由引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V、引物对VI、引物对VII和引物对VIII组成。本发明专利技术还保护同时鉴别口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、产肠毒素大肠杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒和小反刍兽疫病毒的GeXP检测方法。本发明专利技术建立的GeXP检测方法可以同时鉴别8种牛传染病的病原体。本方法具有高通量、特异性和灵敏度较高的特点，可用于牛病流行病学的监测和突发疫情的鉴别诊断，保障养牛业的健康发展。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种同时鉴别8种牛病原体的引物组合及GeXP检测方法。
技术介绍
目前我国现有牛存栏头数1.38亿头，牛肉产量达到675.9万吨，是世界第四大牛肉生产国。近年来广西养牛业发展也十分迅速，拥有全国第5位的牛存栏量，其中水牛存栏数达到450万头，占全国水牛总数的1/5，居全国之首，世界第二。随着养牛业的发展，牛传染病的发病率也在逐年升高，已经成为制约养牛业发展的一大重要因素，具体表现为：老病仍在流行，并且病原出现了新的血清型或变异株，新疾病陆续出现，给牛病的防控带来困难。每年大量牛因疾病死亡，造成了严重的经济损失，据统计2015年全年国内肉牛的因传染病全程死亡率高达5％，导致的直接经济损失高达90-150亿元，牛传染病严重地影响了我国肉类及其制品进入国际市场。口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)、蓝舌病病毒(Bluetongue Virus，BTV)、水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrheal Virus，BVDV)，牛轮状病毒(Bovine Rotavirus，BRV)，产肠毒大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)、牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，IBRV)和小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV)是严重危害养牛业的8种主要传染性疾病的病原体，这些病原体的存在，时时刻刻危害着养牛业的发展。由FMDV引发的牛口蹄疫、由VSV引发的牛水泡性口炎和由BTV引发的牛蓝舌病病是牛的高度急性传染病，一般呈暴发性流行，临床上在口腔，蹄部及乳房出现病变，症状十分相似难以区分，死亡率高，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。BVDV，BRV和ETEC也是引起牛腹泻的主要病原体，且BVDV以持续性感染无症状形式存在，牛群中相当一部分牛是这些病原体的携带者，并且常随着其它病暴发，患病牛的症状为急性水样腹泻，急速消瘦。IBRV属于免疫抑制性疾病病毒，感染机体后还可继发细菌感染，据调查不仅各品种的牛均有感染的报道，而且感染地区遍布全国各省市，感染率居高。由PPRV引发的小反刍兽疫病也是近年来出现在的外来新病，OIE将其列为必须报告的动物疫病，在我国列为一类动物疫病。这些疾病是养牛业的巨大潜患，一旦暴发，将会造成巨大的经济损失，因此开展牛传染病的快速检测技术的研究势在必行。快速准确地检测诊断传染病是进行有效防控的前提和基础。目前用于鉴别诊断这些牛传染病的主要方法有病原分离鉴定和血清学试验等，但这些方法常受临床病料新鲜度、污染程度或血清效价的限制，导致结果有误，且耗时耗力，在实际应用中有一定的局限性。随着分子生物学的进步，以PCR技术为基础发展起来的分子生物学诊断方法已广泛应用于传染病的检测诊断，包括PCR、荧光PCR和LAMP等，但这些方法只能对单一或2至4种病原体进行检测，无法实现真正意义上的同时对多种病原体实行高通量检测。GeXP多基因表达分析系统是一种新型的高通量的基因检测技术，将多重PCR技术和毛细管电泳技术有效的结合起来，采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物(即基因特异性引物5’端连接通用引物)相结合从而引发多重PCR体系的扩增，可同时对多达30个目的基因进行有效检测分析，实现真正意义上的高通量检测鉴别多种病原体的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种同时鉴别8种牛病原体的引物组合及GeXP检测方法。本专利技术提供了一种引物组合，由引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V、引物对VI、引物对VII和引物对VIII组成；所述引物对I由引物FMDV-F和引物FMDV-R组成；所述引物FMDV-F为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)序列表的序列1自5′末端第19至36位核苷酸所示的单链DNA分子；(a3)将(a1)或(a2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物FMDV-R为如下(a4)或(a5)或(a6)：(a4)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a5)序列表的序列2自5′末端第20至43位核苷酸所示的单链DNA分子；(a6)将(a4)或(a5)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对II由引物BTV-F和引物BTV-R组成；所述引物BTV-F为如下(a7)或(a8)或(a9)：(a7)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a8)序列表的序列3自5′末端第19至41位核苷酸所示的单链DNA分子；(a9)将(a7)或(a8)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BTV-R为如下(a10)或(a11)或(a12)：(a10)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a11)序列表的序列4自5′末端第20至37位核苷酸所示的单链DNA分子；(a12)将(a10)或(a11)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对III由引物VSV-F和引物VSV-R组成；所述引物VSV-F为如下(a13)或(a14)或(a15)：(a13)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a14)序列表的序列5自5′末端第19至38位核苷酸所示的单链DNA分子；(a15)将(a13)或(a14)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物VSV-R为如下(a16)或(a17)或(a18)：(a16)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a17)序列表的序列6自5′末端第20至38位核苷酸所示的单链DNA分子；(a18)将(a16)或(a17)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对IV由引物BVDV-F和引物BVDV-R组成；所述引物BVDV-F为如下(a19)或(a20)或(a21)：(a19)序列表的序列7所示的单链DNA分子；(a20)序列表的序列7自5′末端第19至36位核苷酸所示的单链DNA分子；(a21)将(a19)或(a20)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物BVDV-R为如下(a22)或(a23)或(a24)：(a22)序列表的序列8所示的单链DNA分子；(a23)序列表的序列8自5′末端第20至44位核苷酸所示的单链DNA分子；(a24)将(a22)或(a23)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对V由引物BRV-F和引物BRV-R组成；所述引物BRV-F为如下(a25)或(a26)或(a27)：(a25)序列表的序列9所示的单链DNA分子；(a26)序列表的序列9自5′末端第19至40位核苷酸所示的单链DNA分子；(a27)将(a25)或(a26)经过一个或几个核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物组合，由引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V、引物对VI、引物对VII和引物对VIII组成；所述引物对I由引物FMDV‑F和引物FMDV‑R组成；所述引物FMDV‑F为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)序列表的序列1自5′末端第19至36位核苷酸所示的单链DNA分子；(a3)将(a1)或(a2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物FMDV‑R为如下(a4)或(a5)或(a6)：(a4)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a5)序列表的序列2自5′末端第20至43位核苷酸所示的单链DNA分子；(a6)将(a4)或(a5)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对II由引物BTV‑F和引物BTV‑R组成；所述引物BTV‑F为如下(a7)或(a8)或(a9)：(a7)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a8)序列表的序列3自5′末端第19至41位核苷酸所示的单链DNA分子；(a9)将(a7)或(a8)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BTV‑R为如下(a10)或(a11)或(a12)：(a10)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a11)序列表的序列4自5′末端第20至37位核苷酸所示的单链DNA分子；(a12)将(a10)或(a11)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对III由引物VSV‑F和引物VSV‑R组成；所述引物VSV‑F为如下(a13)或(a14)或(a15)：(a13)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a14)序列表的序列5自5′末端第19至38位核苷酸所示的单链DNA分子；(a15)将(a13)或(a14)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物VSV‑R为如下(a16)或(a17)或(a18)：(a16)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a17)序列表的序列6自5′末端第20至38位核苷酸所示的单链DNA分子；(a18)将(a16)或(a17)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对IV由引物BVDV‑F和引物BVDV‑R组成；所述引物BVDV‑F为如下(a19)或(a20)或(a21)：(a19)序列表的序列7所示的单链DNA分子；(a20)序列表的序列7自5′末端第19至36位核苷酸所示的单链DNA分子；(a21)将(a19)或(a20)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物BVDV‑R为如下(a22)或(a23)或(a24)：(a22)序列表的序列8所示的单链DNA分子；(a23)序列表的序列8自5′末端第20至44位核苷酸所示的单链DNA分子；(a24)将(a22)或(a23)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对V由引物BRV‑F和引物BRV‑R组成；所述引物BRV‑F为如下(a25)或(a26)或(a27)：(a25)序列表的序列9所示的单链DNA分子；(a26)序列表的序列9自5′末端第19至40位核苷酸所示的单链DNA分子；(a27)将(a25)或(a26)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物BRV‑R为如下(a28)或(a29)或(a30)：(a28)序列表的序列10所示的单链DNA分子；(a29)序列表的序列10自5′末端第20至37位核苷酸所示的单链DNA分子；(a30)将(a28)或(a29)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对VI由引物ETEC‑F和引物ETEC‑R组成：所述引物ETEC‑F为如下(a31)或(a32)或(a33)：(a31)序列表的序列11所示的单链DNA分子；(a32)序列表的序列11自5′末端第19至36位核苷酸所示的单链DNA分子；(a33)将(a31)或(a32)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物ETEC‑R为如下(a34)或(a35)或(a36)：(a34)序列表的序列12所示的单链DNA分子；(a35)序列表的序列12自5′末端第20至40位核苷酸所示的单链DNA分子；(a36)将(a34)或(a35)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对VII由引物IBRV‑F和引物IBRV‑R组成；所述引物IBRV‑F为如下(a37)或(...

【技术特征摘要】
1.引物组合，由引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V、引物对VI、引物对VII和引物对VIII组成；所述引物对I由引物FMDV-F和引物FMDV-R组成；所述引物FMDV-F为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)序列表的序列1自5′末端第19至36位核苷酸所示的单链DNA分子；(a3)将(a1)或(a2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物FMDV-R为如下(a4)或(a5)或(a6)：(a4)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a5)序列表的序列2自5′末端第20至43位核苷酸所示的单链DNA分子；(a6)将(a4)或(a5)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对II由引物BTV-F和引物BTV-R组成；所述引物BTV-F为如下(a7)或(a8)或(a9)：(a7)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a8)序列表的序列3自5′末端第19至41位核苷酸所示的单链DNA分子；(a9)将(a7)或(a8)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物BTV-R为如下(a10)或(a11)或(a12)：(a10)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a11)序列表的序列4自5′末端第20至37位核苷酸所示的单链DNA分子；(a12)将(a10)或(a11)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对III由引物VSV-F和引物VSV-R组成；所述引物VSV-F为如下(a13)或(a14)或(a15)：(a13)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a14)序列表的序列5自5′末端第19至38位核苷酸所示的单链DNA分子；(a15)将(a13)或(a14)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物VSV-R为如下(a16)或(a17)或(a18)：(a16)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a17)序列表的序列6自5′末端第20至38位核苷酸所示的单链DNA分子；(a18)将(a16)或(a17)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对IV由引物BVDV-F和引物BVDV-R组成；所述引物BVDV-F为如下(a19)或(a20)或(a21)：(a19)序列表的序列7所示的单链DNA分子；(a20)序列表的序列7自5′末端第19至36位核苷酸所示的单链DNA分子；(a21)将(a19)或(a20)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物BVDV-R为如下(a22)或(a23)或(a24)：(a22)序列表的序列8所示的单链DNA分子；(a23)序列表的序列8自5′末端第20至44位核苷酸所示的单链DNA分子；(a24)将(a22)或(a23)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对V由引物BRV-F和引物BRV-R组成；所述引物BRV-F为如下(a25)或(a26)或(a27)：(a25)序列表的序列9所示的单链DNA分子；(a26)序列表的序列9自5′末端第19至40位核苷酸所示的单链DNA分子；(a27)将(a25)或(a26)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物BRV-R为如下(a28)或(a29)或(a30)：(a28)序列表的序列10所示的单链DNA分子；(a29)序列表的序列10自5′末端第20至37位核苷酸所示的单链DNA分子；(a30)将(a28)或(a29)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对VI由引物ETEC-F和引物ETEC-R组成：所述引物ETEC-F为如下(a31)或(a32)或(a33)：(a31)序列表的序列11所示的单链DNA分子；(a32)序列表的序列11自5′末端第19至36位核苷酸所示的单链DNA分子；(a33)将(a31)或(a32)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物ETEC-R为如下(a34)或(a35)或(a36)：(a34)序列表的序列12所示的单链DNA分子；(a35)序列表的序列12自5′末端第20至40位核苷酸所示的单链DNA分子；(a36)将(a34)或(a35)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对VII由引物IBRV-F和引物IBRV-R组成；所述引物IBRV-F为如下(a37)或(a38)或(a39)：(a37)序列表的序列13所示的单链DNA分子；(a38)序列表的序列13自5′末端第19至41位核苷酸所示的单链DNA分子；(a39)将(a37)或(a38)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物IBRV-R为如下(a40)或(a41)或(a42)：(a40)序列表的序列14所示的单链DNA分子；(a41)序列表的序列14自5′末端第20至36位核苷酸所示的单链DNA分子；(a42)将(a40)或(a41)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物对VIII由引物PPRV-F和引物PPRV-R组成：所述引物PPRV-F为如下(a43)或(a44)或(a45)：(a43)序列表的序列15所示的单链DNA分子；(a44)序列表的序列15自5′末端第19至44位核苷酸所示的单链DNA分子；(a45)将(a43)或(a44)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；所述引物PPRV-R为如下(a46)或(a47)或(a48)：(a46)序列表的序列16所示的单链DNA分子；(a47)序列表的序列16自5′末端第20至36位核苷酸所示的单链DNA分子；(a48)将(a46)或(a47)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子。2.权利要求1所述引物组合的应用，为如下(b1)至(b6)中的任意一种：(b1)鉴别8种牛病原体；(b2)制备用于鉴别8种牛病原体的试剂盒；(b3)检测待测病原体是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、产肠毒素大肠杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒或小反刍兽疫病毒；(b4)制备用于检测待测病原体是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、产肠毒素大肠杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒或小反刍兽疫病毒的试剂盒；(b5)检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛轮状病毒和/或产肠毒素大肠杆菌和/或牛传染性鼻气管炎病毒和/或小反刍兽疫病毒；(b6)制备用于检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛轮状病毒和/或产肠毒素大肠杆菌和/或牛传染性鼻气管炎病毒和/或小反刍兽疫病毒的试剂盒；所述8种牛病原体为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、产肠毒素大肠杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒和小反刍兽疫病毒。3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)或(c3)：(c1)鉴别8种牛病原体；(c2)检测待测病原体是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、产肠毒素大肠杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒或小反刍兽疫病毒；(c3)检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛轮状病毒和/或产肠毒素大肠杆菌和/或牛传染性鼻气管炎病毒和/或小反刍兽疫病毒；所述8种牛病原体为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，范晴，谢志勤，邓显文，谢丽基，黄莉，罗思思，黄娇玲，张艳芳，曾婷婷，王盛，刘加波，庞耀珊，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45