本发明专利技术属于农业生物技术领域，本发明专利技术公开了一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组、试剂盒及其应用。本发明专利技术利用专门针对瓜类褪绿黄化病毒(CCYV)、甜瓜坏死斑点病毒(MNSV)、甜瓜黄化斑点病毒(MYSV)等3种病毒的3对特异引物对CCYV‑F/CCYV‑R、MNSV‑F/MNSV‑R、MYSV‑F/MYSV‑R，并结合一步法RT‑PCR检测技术，实现了对3种病毒的同时鉴别。应用本发明专利技术，在提取样品总RNA后，仅需一次RT‑PCR检测即可实现对3种侵染瓜类的RNA病毒的检测，为调查鉴定提供了较为简便的方法。与传统RT‑PCR一次仅能检测一种病毒相比，该法既减少了成本又节约了时间，既保证了灵敏性和特异性同时也简化了操作，是一种特异、灵敏、方便且经济有效的检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物类病毒检测
，尤其涉及一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组、试剂盒，以及鉴定瓜类褪绿黄化病毒、甜瓜坏死斑点病毒、甜瓜黄化斑点病毒的引物对或引物组及其试剂盒。
技术介绍
瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbat chlorotic yellows virus,CCYV)属于长线病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)。基因组由双链RNA组成(即RNA1(8607nt)和RNA2(8041nt))，以介体烟粉虱进行半持久性传播。主要为害西瓜、甜瓜、黄瓜等，以甜瓜大面积发病最为常见。该病最早于2004年在日本观察到，至2010年其病原才被揭示。在我国，古勤生等2007年在宁波、上海等地发现。随后在海南、河南、北京和山东等地有报道。2014-2015年本课题组调查发现，该病在南宁市、北海市部分甜瓜大棚中发病率高达20-70％以上，危害较重。甜瓜坏死斑点病毒(Melon necrotic spot virus，MNSV)属于甜瓜丛矮病毒科(Tombusviridae)香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)，基因组为正义单链RNA，约4.3kb。甜瓜坏死斑点病毒主要通过种子、土壤真菌瓜油壶菌(Olpidium radicale)和黄瓜黑头叶甲进行自然传播，另外也可通过机械接种进行传播，寄主范围限于葫芦科植物西瓜、南瓜、葫芦、黄瓜、甜瓜等，其中甜瓜为系统侵染寄主。该病最早于日本报道，随后在美国、希腊、瑞典、意大利和突尼斯等国家出现。我国于2007年在江苏省海门市温室甜瓜中发现该病，2015年山东寿光也有报道。2015年本课题组调查发现，该病在广西也有发生。甜瓜黄化斑点病毒(Melon yellow spot virus，MYSV)，属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)甜瓜斑萎病毒属(Tospovirus)。基因组包括3个单链线性RNA片段即L RNA、M RNA和S RNA。在植株间主要是通过棕榈蓟马(Thri pspalmi Karny)以持久方式传播，也可通过汁液机械传播。主要为害甜瓜、西瓜、黄瓜和苦瓜等葫芦科作物，该病毒于2000年在日本首次发现并命名，2008年我国台湾的西瓜发现受到该病毒侵染，2009年在海南省三亚市大棚甜瓜被发现受到该病毒侵染。随后，广东的西瓜和山东寿光的黄瓜也有报道。2011年古勤生等调查发现，海南三亚保护地甜瓜上MYSV的发病率为30-100％，造成严重的经济损失。2014年起，本课题组在南宁市、北海市等地的甜瓜大棚中发现该病，发病后期造成甜瓜畸形，丧失经济价值，造成严重的经济损失上述3种病毒均属于RNA病毒。而传统的鉴别方法如：生物学接种法、电镜观察法、血清学检测法、分子生物学方法等方法要么费时费钱，要么需要昂贵的仪器设备，目前，尚未见到使用RT-PCR一次即可区分这3种病毒的方法。本专利技术提供的3对引物组由专利技术人自行设计，并完成了多重PCR的体系优化，引物配比优化等相关工作；多重PCR就是为了减轻工作量，减少耗材的使用等；设计3对引物组，可以扩增不同大小的目的条带，便于区分各病毒。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组、试剂盒及其应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组，包括3对特异性引物对，分别是引物对CCYV-F和CCYV-R、引物对MNSV-F和MNSV-R、引物对MYSV-F和MYSV-R，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的序列。一种用于鉴定瓜类褪绿黄化病毒的引物对，包括特异性引物CCYV-F和CCYV-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列。一种用于鉴定甜瓜坏死斑点病毒的引物对，包括特异性引物MNSV-F和MNSV-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3至SEQ.ID.No.4的碱基序列。一种用于鉴定甜瓜黄化斑点病毒的引物对，包括特异性引物MYSV-F和MYSV-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的碱基序列。一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒，包括反转录试剂、PCR试剂、DEPC水和RNase-free水，其特征在于：所述的PCR试剂中含有3对特异性引物对，分别是引物对CCYV-F和CCYV-R、引物对MNSV-F和MNSV-R、引物对MYSV-F和MYSV-R，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的序列。作为优选，所述的PCR试剂每管20μL，其中2×one Step Buffer 10μL，PrimeScript one Step Enzyme Mix 0.8μL，引物CCYV-F/R各0.2μL、MNSV-F/R各0.2μL、MYSV-F/R各0.3μL，模板RNA 1.2μL及ddH2O 6.6μL。作为优选，所述的引物CCYV-F/R、MNSV-F/R、MYSV-F/R的使用浓度为10μM。本专利技术还提供了所述的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组、所述的引物对或所述的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒在鉴别瓜类褪绿黄化病毒、甜瓜坏死斑点病毒、甜瓜黄化斑点病毒中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的方法是针对目前3种侵染瓜类的RNA病毒(CCYV、MNSV和MYSV)危害严重却又缺乏快速有效鉴别手段的问题，专利技术人根据3种病毒的基因序列分别优化设计了对应的3对特异引物CCYV-F/CCYV-R、MNSV-F/MNSV-R、MYSV-F/MYSV-R，并结合RT-PCR检测技术建立的。2.应用本专利技术的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的方法，在提取样品总RNA后，仅需一次RT-PCR检测即可实现对3种侵染瓜类的RNA病毒的检测，为调查鉴定提供了较为简便的方法。与传统RT-PCR一次仅能检测一种病毒相比，该法既减少了成本又节约了时间，既保证了灵敏性和特异性同时也简化了操作，是一种特异、灵敏、方便且经济有效的检测方法。附图说明图1为本专利技术所建立的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的特异性实验结果图；其中，M-DM2000标准分子量；1-健康甜瓜植株；2-已知感染瓜类褪绿黄化病毒样品；3-已知感染甜瓜坏死斑点病毒样品；4-已知感染甜瓜黄化斑点病毒样品；5已知感染瓜类褪绿黄化病毒、甜瓜坏死斑点病毒和甜瓜黄化斑点病毒的样品。图2为应用本专利技术所建立的同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒方法的实例结果图；其中，M-DM2000标准分子量；1-健康甜瓜植株；2-已知感染瓜类褪绿黄化病毒样品；3-已知感染甜瓜坏死斑点病毒样品；4-已知感染甜瓜黄化斑点病毒样品；5已知感染瓜类褪绿黄化病毒、甜瓜坏死斑点病毒的样品；6-已知感染甜瓜坏死斑点病毒、甜瓜黄化斑点病毒的样品；7-已知感染瓜类褪绿黄化病毒、甜瓜黄化斑点病毒的样品。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步详细的阐述，但本专利技术的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本专利技术，而非用于限制本专利技术的范围。此外，在阅读本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组，其特征在于：包括3对特异性引物对，分别是引物对CCYV‑F和CCYV‑R、引物对MNSV‑F和MNSV‑R、引物对MYSV‑F和MYSV‑R，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的序列。
【技术特征摘要】
1.一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的引物组，其特征在于：包括3对特异性引物对，分别是引物对CCYV-F和CCYV-R、引物对MNSV-F和MNSV-R、引物对MYSV-F和MYSV-R，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的序列。2.一种用于鉴定瓜类褪绿黄化病毒的引物对，包括特异性引物CCYV-F和CCYV-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列。3.一种用于鉴定甜瓜坏死斑点病毒的引物对，包括特异性引物MNSV-F和MNSV-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.3至SEQ.ID.No.4的碱基序列。4.一种用于鉴定甜瓜黄化斑点病毒的引物对，包括特异性引物MYSV-F和MYSV-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的碱基序列。5.一种同步检测3种侵染瓜类的RNA病毒的试剂盒，包括反转录试剂、PCR试剂、DEPC水和RNase-free水，其特征在于：所述的PCR试剂中含有3对特异性引物对，分别是引物对CCYV-F...
【专利技术属性】
技术研发人员：李战彪，谢慧婷，杨世安，秦碧霞，崔丽贤，苏琴，蔡健和，邓铁军，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45
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