本发明专利技术涉及用分子生物学方法对病毒进行定性、定量检测的引物和探针，特别是涉及用实时荧光定量PCR技术对番茄黄化曲叶病毒进行定性、定量检测的引物、TaqMan探针和试剂盒。该引物的上游引物碱基序列如SEQ?ID?NO：1所示，下游引物碱基序列如SEQ?ID?NO：2所示。探针的DNA序列如SEQ?ID?NO：3所示，探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。试剂盒包括上述的引物和探针。本发明专利技术所提供的引物及探针可用于番茄黄化曲叶病毒的定性及定量分析，对判断病毒在植物体内定植规律、复制水平和用药后病毒是否被清除等方面的研究具有重要意义。将在番茄黄化曲叶病毒的大规模检疫、流行病学调查及早期诊断方面发挥重要作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用分子生物学方法对病毒进行定性、定量检测的引物和探针，特别是涉及用实时荧光定量 PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR, FQ-PCR)技术对番茄黄化曲叶病毒进行定性、定量检测的引物、TaqMan探针和试剂盒。
技术介绍
番茄(Zj^o/^rsico/ esculentum Mill.)是世界上重要的蔬菜作物，其品种多，营养丰富，用途广泛。病害的流行和逆境条件会限制番茄生产的发展。番茄黄化曲叶病毒病是制约番茄生产的重要病害之一，该病害引起番茄植株生长缓慢或停滞，开花结果困难，果型小等症状，致使番茄产量和质量严重降低，该病害是由双生病毒科Wriifee )菜豆金色花叶病毒属的番茄黄化曲叶病毒(Jomato yellow leaf curl virus, TYLCV)引起的，并通过烟粉虱Ofeffii1Sia to如ci)传播，随着烟粉虱在世界各地的扩展、农业耕作制度的改变、贸易活动的迅速发展以及气候的变化，番茄黄化曲叶病毒在世界范围内大面积爆发流行，目前已在中美洲、非洲、加勒比海地区、美国的加州和佛罗里达州、中东、 地中海地区、东南亚地区、墨西哥、印度、澳大利亚、日本及中国等众多的地区和国家发生 (叶青静，杨悦俭，王荣青，李志邈，阮美颖，周国治，姚祝平，番茄抗黄化曲叶病育种研究进展，中国农业科学，2009,42 ) 1230-1242)。番茄黄化曲叶病毒的危害在全球范围内日益猖獗，为了控制这类病毒，对其进行检测。常用的检测方法有血清学方法、分子生物学方法和生物学检测法。生物学检测法是通过番茄表型症状来判断是否感染发病，该方法受观察的主观性和症状产生的不确定性影响而具有一定的缺点。目前酶联免疫吸附试验(ELISA)是应用最广泛的血清学检测方法， 该方法抗血清制备需要时间较长，经常存在假阳性反应，并且很难检测出早期的病毒感染。 而分子生物学方法在敏感性和检测速度上明显提高，而且可以进行定量。PCR技术具有特异性强、快速、准确等特点，在病原体检测、疾病诊断、法医学鉴定等方面得到了广泛的应用，并且是分子生物学领域常规的方法和手段。PCR技术自1985年建立以来，不断得到改进，1996年，美国Applied Biosystems公司推出了实时荧光定量 PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR, FQ-PCR)技术，该技术是在常规 PCR 定性技术基础上发展起来的核酸定量技术，是指在PCR反应体系中加入引物对的同时加入特异性荧光探针(TaqMan探针)，探针与模板特异性结合，其结合位点位于引物对之间，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程。实时荧光定量PCR技术具有更强的特异性、自动化程度高、无EB污染等特点，是快速分子诊断的发展趋势。PCR技术为快速、准确地检测番茄植株和介体烟粉虱体内的TYLCV提供技术支持， 对快速检测番茄黄化曲叶病毒暴发病情具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术目的是提供用于对番茄黄化曲叶病毒(TYLCV )进行定性、定量检测的引物。本专利技术所提供的引物，其上游引物碱基序列如序列表中SEQ ID NO 1所示，下游引物碱基序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。序列表中的SEQ ID NO :1由23个碱基组成，该序列为番茄黄化曲叶病毒 (TYLCV-CH JF414236. 1)基因自5，端第856-878位碱基的反向互补序列，SEQ ID NO 2由 18个碱基组成，该序列为TYLCV基因自5’端第756-773位碱基，扩增片段长度为12!3bp。由上述引物衍生的引物序列也属于本专利技术的保护范围。所述衍生序列是指在SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。上述引物既适用于番茄黄化曲叶病毒的实时荧光定量PCR检测，也可用于该病毒的常规PCR检测，其检测对象是TYLCV基因。用上述引物对待测样品进行PCR扩增，扩增产物有123bp大小的条带，则样品中含有ITLCV。本专利技术还提供了用于对TYLCV进行定性、定量检测的TaqMan探针。本专利技术所提供的TaqMan探针，其DNA序列如序列表中SEQ ID NO 3所示；所述探针是经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。所述报告荧光基团可为FAM、VIC等，淬灭荧光基团可为TAMRA、MGB等。将序列表中SEQ ID NO 3的TaqMan探针命名为TaqManProbe，序列表中的SEQ ID NO 3由31个碱基组成，该序列为番茄黄化曲叶病毒(ITLCV-CH JF414236. 1)基因自5，端第824-邪4位碱基的反向互补序列，第832位的碱基为G ；同时，该序列为番茄黄化曲叶病毒(ITLCV-IL ；FR851297. 1)基因自5，端第拟4_邪4位碱基的反向互补序列，第832位的碱基为T。上述TaqMan探针序列的衍生序列也属于本专利技术的保护范围。所述衍生序列是指在SEQ ID NO 3的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。本专利技术的第三个目的是提供一种检测ITLCV的实时荧光定量PCR试剂盒。本专利技术所提供的检测TYLCV的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括盒体和8 支PCR管，在5支PCR管中分别装有dNTP，MgCl2, PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶和ddH20 ；其中，在另外3支PCR管中分别装有检测TYLCV的上游引物SEQ ID NO :1，下游引物SEQ ID NO :2，探针 SEQ ID NO :3。本专利技术提供了用于对番茄黄化曲叶病毒进行定性、定量检测的引物和TaqMan探针，通过提取待测样品的DNA，并结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测样品中TYLCV的目的。本专利技术的有益效果1、本专利技术所提供的引物及探针可用于番茄黄化曲叶病毒的定性及定量分析，对判断病毒在植物体内定植规律、复制水平和用药后病毒是否被清除等方面的研究具有重要意义；2、本专利技术将在番茄黄化曲叶病毒的大规模检疫、流行病学调查及早期诊断方面发挥重要作用。附图说明图1为杭州地区(HZ)与海宁地区(HN)感染ITLCV样品PCR扩增产物的琼脂糖凝4胶电泳检测结果。图2为菌落PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图3为阳性克隆质粒pMDIS-T-ITLCV的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图4为不同稀释浓度pMDIS-T-ITLCV标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线。图 5 为 07-020、07-025、07-(^6、07-027、07-040 和 07-0296 样品的实时荧光定量 PCR扩增曲线。图6为检测TYLCV的实时荧光定量PCR标准曲线及待测样品在标准曲线上的位点ο具体实施例方式通过以下实施例并结合附图对本专利技术作进一步的详细说明，但以下描述不对本专利技术的保护范围构成任何意义上的限定。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物和探针由大连宝生物技术公司合成，所有序列测定工作均由上海生物技术有限公司完成。实施例1、(用于对TYLCV进行定性、定量检测的弓丨物及TaqMan探针的设计) 根据G本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶青静，杨悦俭，王荣青，周国治，阮美颖，姚祝平，李志邈，万红建，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。