本发明专利技术公开了一种用于检测BK病毒的引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。所述引物和探针包括：用于检测BK病毒的正向引物、用于检测BK病毒的反向引物和用于检测BK病毒的探针。所述试剂盒包括上述的引物和探针。所述引物、探针和试剂盒，具有灵敏度高的特性，且检测速度快，整个检测过程共仅需2～3小时。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种用于检测BK病毒的引物、探针和试剂 盒。
技术介绍
BK 病毒（BK virus，BKV)是多瘤病毒（polyomaviruses，PV)的一种。BK 病毒为无 被膜环状双链病毒，呈全球性分布。流行病学表明90%以上健康成人既往有BK病毒感染 史，患者免疫功能低下时BK病毒重新激活，可出现BK病毒尿症。据报道，约45%肾脏移植 受者出现病毒激活，的肾移植患者出现BK病毒相关性肾病（BK virus associated n印hropaty，BKVAN)，其中60% -70%会导致移植肾丧失功能。除此之外，BK病毒的感染还 与骨髓移植患者的出血性膀胱炎、输尿管狭窄、进行性多灶性脑白质病、肺部疾病、肿瘤、自 身免疫性疾病等有关。BK病毒往往潜伏在肾脏中，在免疫抑制状态下机体才可能会发病， 如获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immuno-deficiency Syndrome，AIDS)、先天性免疫功 能缺陷和接受化疗的恶性肿瘤患者以及应用免疫抑制剂治疗的实体器官移植及骨髓移植 受者。对于接受免疫抑制治疗的人特别是肾移植后的患者，BK病毒容易再次激活且大量复 制，导致疾病。由于目前缺乏有效针对BK病毒的抗病毒治疗手段，使得持续、有效地对BK 病毒感染进行监测显得尤为重要。 在目前BK病毒感染的检测中采用病毒血清学检测法，具体采用酶免疫分析法 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测BK病毒的抗体滴度，但此方法检测速 度慢且特异性不高。
技术实现思路
为了解决现有技术中检测BK病毒的速度慢且特异性不高的问题，本专利技术实施例 提供了一种用于检测BK病毒的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如下： -方面，本专利技术实施例提供了一种用于检测BK病毒的引物和探针，所述引物和探 针包括：用于检测BK病毒的正向引物、用于检测BK病毒的反向引物和用于检测BK病毒的 探针，其中， 所述用于检测BK病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示； 所述用于检测BK病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示； 所述用于检测BK病毒的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示； 所述探针的5'端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3或Cy5,所述 探针的 3' 端连接有淬灭基团 TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。 另一方面，本专利技术实施例提供了一种用于检测BK病毒的试剂盒，所述试剂盒包括 上述引物和探针。 具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控 品、阴性质控品和工作标准品。 具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作 标准品4,其中， 所述工作标准品1为1 x 107拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段； 所述工作标准品2为1 X 106拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段； 所述工作标准品3为1 X 105拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段； 所述工作标准品4为1 X 104拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段。 具体地，所述阳性质控品为1. OX 106拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段。 具体地，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0. 05-0. 9 yM，所述探针的终 浓度为 0.05-0. 9 yM。 具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、终浓度为0. 2~0. 6mM的dNTPs、10XPCR缓冲液和终浓度为 1. 5~5. OmM的含Mg离子的溶液。 具体地，所述核酸释放剂包括无菌水、终浓度为0. 03-0. 3 %的聚乙二醇辛基苯基 醚、终浓度为0. 04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH值为8. 3的终浓度为0. 01-0. 1M 的三（羟甲基）氨基甲烷。 具体地，所述临界阳性质控品为1. ox 104拷贝/mL的所述BK病毒的基因片段。 具体地，所述阴性质控品为浓度0. 8%的生理盐水。 本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术实施例提供的用于检测 BK病毒的引物和探针，具有灵敏度高的特性，使得本专利技术实施例提供的用于检测BK病毒的 试剂盒，具有灵敏度高的特性，采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测 结果可靠，提高了检测的灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段该试剂盒也可以进行有效 的检测；检测速度快，整个检测过程共仅需2~3小时。【附图说明】 为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。 图1是本专利技术实施例2提供的荧光扩增曲线图； 图2是本专利技术实施例3提供的荧光扩增曲线图； 图3是本专利技术实施例4提供的荧光扩增曲线图； 图4是本专利技术实施例5提供的标准曲线的荧光扩增曲线图； 图5是本专利技术实施例5提供的荧光扩增曲线图； 图6是本专利技术实施例5提供的由图4得到的标准曲线图，图6横坐标为Log Starting Quantity copy number，纵坐标为 Threshold Cycle。 图中：Cycles 为循环数，RFU 为焚光值，Log Starting Quantity copy number 为 水痘带状疱瘆病毒起始浓度的对数值，Ct (Threshold Cycle)值为循环数；la-实施例2中 样品1，4a-实施例2中样品4, 5a-实施例2中样品5,6a-实施例2中样品6, 7a-实施例2 中样品7。【具体实施方式】 为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术实施方 式作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂和探针主要购自宝生物工程（大连）有限 公司。 实施例1. 一种用于BK病毒核酸定量检测的引物和荧光探针 本专利技术实施例提供了一种用于检测BK病毒的引物和探针，引物和探针包括：用于 检测BK病毒的正向引物、用于检测BK病毒的反向引物和用于检测BK病毒的探针，其中， 用于检测BK病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示； 用于检测BK病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示 用于检测BK病毒的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示； 探针的5'端连接有荧光基团？411、册乂、了￡1\1(^、￥1(：、1?(?、〇73或〇75，探针的3' 端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本专利技术实施例中，探针 的荧光报告基团为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm ;淬灭基团为Eclipse。 纯化方式可选自：HAP、PAGE和HPLC纯化方式，具体地引物和探针如下表： 表1.BK病毒引物和探针【主权项】1. 一种用于检测BK病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：用于检测 BK病毒的正向引物、用于检测BK病毒的反向引本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测BK病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：用于检测BK病毒的正向引物、用于检测BK病毒的反向引物和用于检测BK病毒的探针，其中，所述用于检测BK病毒的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述用于检测BK病毒的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述用于检测BK病毒的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述探针的5’端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述探针的3’端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘茹，桑筱筱，
申请(专利权)人：湖北永邦医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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