本发明专利技术公开了一种用于RET融合基因检测的引物、探针，包括RET融合突变特异性反转录引物及RET基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；一种用于RET融合基因检测的检测试剂盒，包括mRNA反转录cDNA体系，所述的mRNA反转录cDNA体系用于所述的检测试剂盒的PCR反应；本发明专利技术采用了特异引物和探针技术，可以特异检测人类RET基因融合突变；建立了实时荧光PCR体系，可同时检测RET基因17种融合突变；灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；操作简单，检测廉价，临床应用范围广；样本检测范围广，样本可以为新鲜病理组织，石蜡包埋组织或胸腔液；检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于RET融合基因检测的引物、探针及 检测试剂盒。
技术介绍
肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率居各种癌症之首。每年 全世界有超过130万的患者死于肺癌，近一半发生在发展中国家。据2010年我国卫生部 的统计，肺癌死亡率为30. 83/10万，肺癌已经成为发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤。 (Orras JM, Fernandez E, Gonzalez JR, et al. Lung cancer mortality in European regions(1955-1997). Ann Oncol, 2003, 14(1) :159-161;中华人民共和国卫生部，《2010年 中国卫生统计》年鉴)。 肺癌从组织病理学上可以分为小细胞肺癌（SCLC)和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC)两大类，其中非小细胞肺癌约占肺癌总病例的85%。在我国肺 癌患者5年生存率仅为13%，其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测 和确诊技术，以及与之相配的科学治疗方案，从而使患者错失了治疗的最佳时机。目前化疗仍是肺癌的主要治疗手段，然而多数化疗会产生较大的毒副作用，不同 患者间的化疗效果会有较大差异。随着肿瘤分子生物学的发展，肺癌的分子靶向治疗因其 特异性高，毒副作用低，日益成为临床医生首选治疗方式。RET基因为原癌基因，定位于第 10号外显子的qll. 2位置，编码一个受体酪氨酸激酶。研宄发现，RET基因在乳头状甲状腺 癌和非小细胞肺癌中还可以和0〇?：6，％(^4，？服41?认，11?頂24，6011^5，11?頂33，1〇^1， ERC1, MBD1 和 TRIM27发生融合，激活下游RAS/MAPK/ERK, PI3K/AKT,和 phospholipase 〇 信号途径，引起癌症的发生（Gainor JF，Shaw AT，The 0ncologist2013;18:865 - 875 )〇 以卡博替尼、凡德他尼为代表的药物是针对RET基因融合突变开发的小分子靶向 药物，通过抑制RET酪氨酸激酶区域的活性，阻断其下游异常信号通路，从而抑制肿瘤细胞 的生长。临床研宄表明卡博替尼对RET融合突变患者的有效率可达61%以上，而对野生型 的患者几乎没有疗效。因此，检测RET融合突变情况是指导卡博替尼类药物用药的前提和 基础，在治疗之前通过高敏度的检测方法检测RET融合基因突变对于提高患者的生存率， 延长生存期，提高生存质量有着重要意义。 目前，RET融合突变的检测方法主要为荧光原位杂交（FISH)法，然而FISH法检 测特异性差，灵敏度低，检测时间长。此外，FISH检测需要昂贵的专用仪器设备，试剂成本 较高，操作复杂，使临床检测广泛使用受到了限制。FISH检测要求检测样本保存时间不宜 过长，采用保存时间长的样本进行检测会导致假阴性的发生，影响了检测的准确性。因此， FISH检测法无法满足临床医生检测实际应用的需求，临床迫切需要开发一种高灵敏度的可 以同时检测RET多种基因融合的检测方法，以实现快速对RET多种融合突变进行同时检测， 从而为临床肺癌个体化治疗方案提供科学参考依据。
技术实现思路
本专利技术的目的：提供一种用于RET融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒，可以 一次同时检测RET基因的17种融合突变，检测灵敏度高，检测时间只需90分钟即可完成， 同时具备了灵敏度高，特异性好，廉价快速，操作简单等优点，可以满足临床快速检测的实 际需求。 为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是： 一种用于RET融合基因检测的引物、探针，包括RET融合突变特异性反转录引物及RET 基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；所述的RET融合突变特异性反转录引物 具体为： RET 反转录 1 : TGAAGGAGAAGAGGACAGCG SEQ ID NO ：01 RET 反转录 2 : CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC SEQ ID NO ：02 RET 反转录 3 : CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO ：03 Actin 反转录 4: CAGGAGGAGCAATGATCTTG SEQ ID NO ：04〇 所述的RET基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列包括KIF5B和RET-12 基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、（XD1、（XD2、ERC和RET-12基因融合突 变检测特异性引物和探针核苷酸序列、G0LGA7F、NC0A8F、H00K11F和RET-12基因融合突变 检测特异性引物和探针核苷酸序列、PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET-12基因融合突变检 测特异性引物和探针核苷酸序列、TRM24、TRIM33和RET-12基因融合突变检测特异性引物 和探针核苷酸序列、KIF5B-24和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列 及KIF5B-15和RET-11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；所述的KIF5B和 RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为： KIF15F GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT SEQ ID NO ：05 KIF16F TAGCAGCATGTCAGCTTCGTAT SEQ ID NO :06 KIF22F CTCTTTGTTCAGGACCTGGCTAC SEQ ID NO :07 KIF23F AATCTTGAACAGCTCACTAAAGTGC SEQ ID NO :08 RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO :09 Taqman Retl2 FAM-5- ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID N0:10。 所述的(XD1、(XD2、ERC和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序 列具体为： CCDC1F GCACTGCAGGAGGAGAACC SEQ ID NO ：11 CCDC2F TTCCTCACTAATGAGCTCTCCAG SEQ ID NO: 12 ERC11F TTGGAGCAGAAGAAGGAGGAG SEQ ID NO: 13 RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO ：14 Taqman Ret12 FAM-5- ATCCAAAGTGGGAATTCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO: 15。 所述的G0LGA7F、NC0A8F、H00K11F和RET-12基因融合突变检测特异性引物和探针 核苷酸序列具体为： G0LGA7F GAAGCTGATGGGCCAGATACAT SEQ ID NO ：16 NCOA8F CAGGACTGGCTTACCCAAAAG SEQ ID NO: 17 HOOK11F AGTTAAGAAAGGCCAACGCAG SEQ ID NO: 18 RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO: 19 Taqman Retl2 FAM-5-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于RET融合基因检测的引物、探针，其特征在于：包括RET融合突变特异性反转录引物及RET基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；所述的RET融合突变特异性反转录引物具体为：RET反转录1： TGAAGGAGAAGAGGACAGCG SEQ ID NO：01RET反转录2： CACCGGAAGAGGAGTAGCTGAC SEQ ID NO：02RET反转录3： CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO：03Actin反转录4： CAGGAGGAGCAATGATCTTG SEQ ID NO：04；所述的RET基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列包括KIF5B和RET‑12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、CCD1、CCD2、ERC和RET‑12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、GOLGA7F、NCOA8F、HOOK11F和RET‑12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET‑12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、TRIM24、TRIM33和RET‑12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列、KIF5B‑24和RET‑11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列及KIF5B‑15和RET‑11基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列；所述的KIF5B和RET‑12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：KIF15F GAAATAGGAATTGCTGTGGGAAAT SEQ ID NO：05KIF16F TAGCAGCATGTCAGCTTCGTAT SEQ ID NO：06KIF22F CTCTTTGTTCAGGACCTGGCTAC SEQ ID NO：07KIF23F AATCTTGAACAGCTCACTAAAGTGC SEQ ID NO：08RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO：09Taqman Ret12 FAM‑5‑ ATCCAAAGTGGGAATTCC‑3‑BHQ‑MGB SEQ ID NO：10；所述的CCD1、CCD2、ERC和RET‑12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：CCDC1F GCACTGCAGGAGGAGAACC SEQ ID NO：11CCDC2F TTCCTCACTAATGAGCTCTCCAG SEQ ID NO：12ERC11F TTGGAGCAGAAGAAGGAGGAG SEQ ID NO：13RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO：14Taqman Ret12 FAM‑5‑ ATCCAAAGTGGGAATTCC‑3‑BHQ‑MGB SEQ ID NO：15；所述的GOLGA7F、NCOA8F、HOOK11F和RET‑12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：GOLGA7F GAAGCTGATGGGCCAGATACAT SEQ ID NO：16NCOA8F CAGGACTGGCTTACCCAAAAG SEQ ID NO：17HOOK11F AGTTAAGAAAGGCCAACGCAG SEQ ID NO：18RET12R CCAAATTCGCCTTCTCCTAGAG SEQ ID NO：19Taqman Ret12 FAM‑5‑ ATCCAAAGTGGGAATTCC‑3‑BHQ‑MGB SEQ ID NO：20；所述的PCM29F、PRKAR7F、KTN29F和RET‑12基因融合突变检测特异性引物和探针核苷酸序列具体为：PCM29F GACCGGCAAATTAAAGCAATTAT SEQ ID NO：21PRKAR7F AATGTGAAATTGTGGGGCATC SEQ ID NO：22KTN29F GCCATGCTAAAAGAGA...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张道允，巩子英，
申请(专利权)人：上海允英医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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