当归的检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了当归的核苷酸序列，还公开了检测前述序列的试剂在制备当归检测试剂中的用途，以及当归的检测试剂盒和检测方法。本发明专利技术检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的鉴别当归，特异性强，耗时短，应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】
当归的检测试剂盒和检测方法
本专利技术涉及一种当归的检测试剂盒和检测方法。
技术介绍
当归，是伞形科植物当归AngelicaSinensis(Oliv.)Diels的干燥根，原主产地在我国甘肃东南部，其中以岷县产量多，质量好，其次为云南、四川、陕西、湖北等省，均为栽培。国内其它省区也已有引种栽培。其根可入药，是最常用的中药之一。具有补血和血、调经止痛、润燥滑肠之功效。欧当归和日本当归是常见的当归伪品。欧当归(LevisticumofficinalisKoch)根茎可入药，有兴奋、发汗、利尿、解热等功效，在河北、山东、河南、陕西、山西、江苏等省区均有种植栽培，民间用以代当归用，但是其有当归不具有的不良反应，不能混充当归药用。日本当归(Angelicaacutiloba(Sieb.etZucc.)Kitagawa)在我国吉林省的延吉、珲春、和龙等县栽培作“当归”使用已有长久的历史。国内有些省区也已有引种栽培。模式标本产于日本中部横须贺近郊,日本和朝鲜以本种称当归，栽培入药。功效与我国原产当归类似，主治月经不调，经来腹痛，腰痛、崩漏，大便干燥，痢疾腹痛等症。日本当归化学成分、有效含量均有较大的差异，而且在药理作用上也有较大的不同之处。总之，欧当归和日本当归本的药效和当归虽有相似之处，但是在很多功效上有区别，且存在用药安全性问题，不能作为当归使用，然而，由于欧当归、日本当归与当归的性状特征较为相似，通过观察外观形状和显微特性进行鉴别的难度较大，而且欧当归和日本当归易于栽培，产量较高，导致市面上存在许多用欧当归和日本当归以次充好的情况，急需改善。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种新的、方便、快速、准确地检测当归的试剂盒和方法。本专利技术提供了SEQIDNO.1所示的种核苷酸序列。本专利技术还提供了检测SEQIDNO.1所示核苷酸序列的试剂在制备当归检测试剂中的用途。所述检测SEQIDNO.1所述核苷酸序列的试剂包括扩增SEQIDNO.1所示核苷酸序列的试剂。所述当归是伞形科植物当归AngelicaSinensis(Oliv.)Diels的干燥根。所述当归是甘肃岷县当归、甘肃平凉当归、四川九寨当归、云南丽江当归或四川绵阳当归。所述扩增的试剂包括SEQIDNO.2～3所示的引物对。本专利技术检测当归的试剂盒，包括检测SEQIDNO.1所述核苷酸序列的相关试剂。所述试剂包括扩增SEQIDNO.1所示核苷酸序列的试剂。所述扩增的试剂包括SEQIDNO.2～3所示的引物对。本专利技术一种当归的检测方法，包括如下步骤：a，DNA提取：提取待检样本中的DNA；b，检测：用前述的试剂盒检测待检样本，即可。本专利技术SEQIDNO.1所示核苷酸序列为当归特异性序列，通过检测这些序列可以有效区分当归与当归伪品，鉴定待检样本是否为当归，保证用药安全，本专利技术方法操作简便，具有良好的应用前景。下面通过具体实施方式对本专利技术做进一步详细说明，但是并不是对本专利技术的限制，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，都是本专利技术保护的内容。附图说明图1.各种当归的改良RAPD扩增。引物SBS-A1的RAPD扩增。箭头为A1-0的RPAD片段，用于胶回收和克隆。图2阳性克隆的菌落PCR鉴定。蓝色所指通道的阳性克隆用于Sanger测序。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。泳道1-7分别代表不同阳性克隆的菌落。图3不同物种及当归品种的鉴定。通道1-18号分别为甘肃岷县当归，日本当归，四川阿坝当归，甘肃平凉当归，湖北当归，四川九寨当归，欧当归，云南丽江当归，四川绵阳当归，银杏，荔枝，龙眼，青果，金银花，栀子花，灵芝，龙荔，赶黄草。蓝色所指的通道7为日本当归，通道2为欧当归。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。具体实施方式实施例1RAPD技术扩增当归特异SCAR标记一、CTAB法提取植物DNA取当归0.2g置于1.5mLEP管中，加入液氮约半分钟后用研钵棒碾碎成细粉，立即加入500μl的CTAB提取缓冲液[CTAB2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol.L_1，EDTA20mmolmmol.L_1，NaCL1.4mol.L_1，0.4％的β-巯基乙醇]，60℃水浴保温1小时后，加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)抽提，轻颠倒混匀，10000转每分钟离心10分钟，吸取上清液，取上清加入2/3体积的预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀；12000转每分钟离心10分钟，弃上清，小心倾去上清液，沉淀用70％乙醇和无水乙醇各轻洗一次，弃洗液，留沉淀，空气干燥。用100μl的1×TE溶液溶解备用。将样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，用分光光度计测定浓度，稀释至浓度10ng/μl，-20℃保存备用。详见《精编医学分子生物学实验指导》(中国医药科技出版社，主编：傅俊江)。二、RAPD技术PCR扩增利用RAPD技术进行扩增(参照FuJ,YangL,KhanMA,MeiZ(2013)GeneticcharacterizationandauthenticationofLonicerajaponicaThunb.byusingimprovedRAPDanalysis.MolBiolRep,40(10):5993-9)：以步骤一提取的核酸作为模板，用RAPD引物SBA-A1和SBS-A2进行扩增(序列见表2，北京赛百盛公司合成)，PCR扩增采用10μl反应体系包括：1μl的引物(2.5μmol/L),1.5μl(15ng)模板DNA，5μl的2×PCRTaqMastermix(天根生物公司，北京)和2.5μl的灭菌双蒸水。充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪(AppliedBiosystems96-WellThermalCycler，LifeTechnology,USA)。PCR反应条件是：95℃1分30秒,94℃40秒，36度60秒，72℃1分30秒，40个循环，最后72℃5分钟，其中RAMP为5％。然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，曝光显色。表1琼脂糖凝胶电泳(参见《精编医学分子生物学实验指导》，中国医药科技出版社，主编：傅俊江)：(1)制备1.5％的琼脂糖凝胶，将PCR产物按顺序全部点样到凝胶孔内，同时点样一个DNA分子大小标记(DL2000，TIANGEN公司，北京)。注意：不需要加载样缓冲液，PCR扩增用的2×mix就预加了相关成分。(2)电泳(电泳仪由北京百晶生物有限公司生产，BG-subMIDIcell)，常选择电压110V，电泳时间30min即可，三、RAPD扩增条带的分离1.片段回收1.5％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下剪切图正品当归品种的特异片段A1-0，用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物公司)回收RAPD扩增的DNA片段。2.克隆接着利用pGEM-T载体(PromegaCorporation)和回收RAPD扩增的DNA片段在T4-DNA连接酶作用下连接(16℃连接8小时)。连接后加入30μl活化的DH5α细菌，冰浴30分钟，接着42℃激活45秒，然后冰浴2分钟，再加入300μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.检测SEQIDNO.1所示核苷酸序列的试剂在制备当归检测试剂中的用途。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述检测试剂包括扩增SEQIDNO.1所示核苷酸序列的试剂；所述扩增的试剂包括SEQIDNO.2～3所示的引物对。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述当归是伞形科植物当归AngelicaSinensis(Oliv.)Diels的干燥根。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述当归是甘肃岷县当...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅俊江，梅志强，张春，成竞梁，
申请(专利权)人：泸州医学院，
类型：发明
国别省市：四川;51